Polymerasekædereaktion (PCR). Hvad er det, en metode inden for mikrobiologi, medicin, kultur, udstrygning

Polymerasekædereaktion (PCR) er en moderne laboratoriemetode til generering af et stort antal kopier af individuelle sektioner af nukleinsyrer (DNA eller RNA). PCR bruges inden for mange områder inden for biologi og medicin. I medicinsk diagnostik bruges denne metode til at bestemme infektionssygdomme.

I molekylærbiologi kan formålet med kopiering være et stykke DNA for at studere funktionen af ​​et bestemt gen eller andre eksperimenter (kloning af gener, introduktion af andre gener, identifikation af mutationer). I en retsmedicinsk undersøgelse undersøges DNA for at matche det mistænkte arvemateriale på gerningsstedet.

Hvad er analyse?

Ved diagnosticering af sygdomme ved hjælp af PCR -metoden isoleres en specifik sektion af det infektiøse agens DNA i patientens biologiske materiale. Hvis dette websted findes, er dette et direkte bevis på tilstedeværelsen af ​​patogenet i patientens krop.

PCR kan også registrere ændringer i patientens genetiske materiale., som hjælper med at bestemme medfødte sygdomme, ændringer i immunsystemet, disposition for forskellige sygdomme.

Ved udførelse af PCR -analyse isoleres en bestemt del af DNA- eller RNA -molekylet af sygdomsfremkaldende stof i det biologiske materiale fra prøven ved særlige metoder. Så kopieres dette websted mange gange ved hjælp af enzymer.

Mængden af ​​DNA syntetiseres, som kan optages visuelt. Kun en bestemt del af DNA -molekylet kopieres.

PCR kræver følgende komponenter:

• DNA -skabelon (et stykke DNA, der gentagne gange kopieres og identificeres),
• primere (specielt syntetiserede enkeltstrengede korte DNA-molekyler, der er nødvendige for at frø DNA-syntese),
• DNA -polymerase (et enzym, der katalyserer reaktionen af ​​DNA -polymerisation), deoxynucleosidtrifosfater (nitrogenholdige baser er molekylerne, der danner DNA).
• Andre komponenter (magnesiumioner, bufferopløsning).

Polymerasekædereaktion er en metode, der kræver specielt udstyr (forstærker), den består af følgende trin:

• Denaturering af skabelon-DNA, hvor dobbeltstrenget DNA spaltes i to tråde. Denne fase varer i 30-40 sekunder.
• Vedhæftning af primere til specifikke områder af DNA sker inden for 20-60 sekunder.
• Polymerisering er syntesen af ​​nye DNA -tråde ved hjælp af et enzym.

Efter gentagen gentagelse af disse faser syntetiseres det nødvendige antal kopier (efter 20 cyklusser når antallet af kopier mere end en million).

Registrering af virus -DNA udføres efter amplifikation i en særlig enhed (hvis PCR med detektion i slutpunkt) eller direkte i forstærkeren under reaktionen (hvis der anvendes PCR i realtid) fluorescerende metode.

Hvor kan jeg tjekke ind, hvor meget koster det

PCR -analyse kan udføres i ethvert medicinsk laboratorium, der er akkrediteret til denne analyse.

Prisen for testen afhænger af infektionstypen:

Laboratorium	Infektion / omkostninger
KDL	Cytomegalovirus -DNA - 230 rubler DNA af herpesvirus type 6 - 250 rubler. RNA coronavirus SARS-CoV-2/1600 rubler.
Hemotest	Cytomegalovirus -DNA - 250 rubler DNA af herpesvirus type 6 - 240 rubler. RNA coronavirus SARS-CoV-2-1700 rubler.
Invitro	Cytomegalovirus -DNA i blodet - 400 rubler. DNA fra human herpesvirus 1 og 2 typer til skrabning af hudens epitelceller - 570 rubler. RNA coronavirus SARS-CoV-2-1990 rubler.
Citylab	Cytomegalovirus -DNA - 240 rubler DNA af den humane herpesvirus type 6 - 290 rubler. RNA coronavirus SARS-CoV-2-1800 rubler.

Varianter af PCR

Polymerasekædereaktion er en metode, til hvilken forskellige metoder til opsætning af analysen er blevet udviklet.

Disse metoder var designet til at reducere risikoen for falske positive og falske negative resultater eller til at udføre kvantitative eller kvalitativ analyse, samt til bestemmelse af forskellige nukleinsyrer: DNA (deoxyribonukleinsyre) eller RNA (ribonukleinsyre).

Ifølge metoden til bestemmelse af reaktionsprodukterne skelnes to typer PCR:

• Real-time PCR - forstærkning og detektion udføres samtidigt i en enhed. Med denne ændring af PCR er det muligt at bestemme mængden af ​​den ønskede DNA -sekvens ved hver cyklus af DNA -syntese.
• Slutpunkt PCR - en slags PCR -analyse, hvor resultaterne registreres ved hjælp af fluorescensmetoden i en særlig enhed efter afslutningen af ​​polymerasekædereaktionen.

I laboratoriepraksis er der forskellige måder at oprette analysen på, såsom:

• Hot-start PCR. Det særlige ved denne metode er, at reaktionen først starter, når en bestemt temperatur er nået. Reaktionskomponenterne (især enzymer) blokeres og begynder kun at virke ved en bestemt temperatur. Denne metode forbedrer analysens nøjagtighed. Hvis reaktionsblandingen opvarmes gradvist, er der risiko for dannelse af reaktionsbiprodukter og derfor unøjagtige analyseresultater.
• Til påvisning af vira med et RNA -genomfor eksempel hepatitis C-type eller human immundefektvirus, en metode kaldet reverse transcription PCR (RT-PCR). Virusets RNA omdannes først til et komplementært DNA -molekyle. Det resulterende DNA anvendes derefter som en skabelon til PCR.
• Multi-primer PCR - en metode til at udføre reaktionen, hvor flere DNA -sekvenser samtidigt kopieres i en prøve. Denne metode giver dig mulighed for at reducere forbrugsvarer og reducere omkostningerne ved analyse.
• PCR -metode ved hjælp af NASBA -teknologi (Nukleinsyresekvensbaseret amplifikation) er, at virusets RNA bruges som en skabelon til kopiering af genetisk materiale. Ved hjælp af specielle enzymer (transkriptase, RNA -polymerase, RNase) dannes komplementært DNA (cDNA) i reaktionsmediet samt et kompleks af RNA- og cDNA -molekyler. Forskellen mellem denne ændring og standard PCR er, at ikke DNA, men RNA akkumuleres som genetisk materiale. Forskellen mellem denne metode og RT-PCR-metoden er, at RNA ikke kun er en skabelon til cDNA-syntese, men også et amplifikationsprodukt (det vil sige det endelige produkt af reaktionen).

DNA -molekyler ødelægges i kroppen i meget lang tid og kan påvises hos en patient, selvom antiviral eller antibiotisk terapi allerede har virket. Derfor tillader standard PCR -metoden ikke at evaluere terapiens effektivitet.

I modsætning til DNA kan RNA -molekyler udelukkende isoleres fra levende celler eller vira, og efter ødelæggelse af levende celler ødelægges RNA -molekylet også hurtigt. Denne ændring giver dig mulighed for at kontrollere effekten af ​​terapi allerede på tidspunktet for dens implementering.

Fordele og ulemper ved PCR

Sammenlignet med andre laboratoriemetoder til påvisning af infektioner har PCR -metoden flere fordele:

• PCR -metoden er en direkte metode bestemmelse af det genetiske materiale af en virus eller bakterier i en prøve. I modsætning til andre metoder, der bestemmer indirekte tegn på infektion, indikerer PCR -testen direkte tilstedeværelsen af ​​en virus i kroppen.
• Høj specificitet af metoden, det vil sige evnen til at identificere et specifikt patogen er forbundet med det faktum, at der bestemmes genetisk materiale, der er unikt for en given organisme (virus, bakterier, mikroskopisk svamp). Derfor er specificiteten af ​​denne metode tæt på 100%.
• Høj følsomhed af metoden (også tæt på 100%) er mængden af ​​prøve, der kan bestemmes ved denne metode. Selv en lille mængde virus eller bakteriemolekyler i biologisk materiale bestemmes. Dette gør det muligt at identificere bæreren af ​​virussen, selv før symptomerne begynder.
• Metoden er universel til påvisning af DNA / RNA for eventuelle vira eller bakterier. Ved hjælp af PCR er det muligt at bestemme eventuelle infektioner såvel som kroniske sygdomme.
• Hurtig analysemetode, varighed er omkring 4-6 timer.

Fejl:

• Polymerasekædereaktionen er en metode til direkte påvisning af patogenets genetiske materiale (DNA), og det tillader ikke vurdere terapiens effektivitet, da DNA -molekylet ikke ødelægges i lang tid, selvom behandlingen allerede er arbejdede.
• Metodens høje følsomhed kan være dens ulempe. F.eks. Efter afsluttet behandling detekterer PCR stadig DNA'et fra døde celler i en rask patient og får derved et falsk positivt resultat.
• Forskellige producenter af PCR -test kan påvise de samme infektioner ved hjælp af forskellige systemer. Derfor kan resultaterne af bestemmelse af den samme infektion i laboratorier variere. Det anbefales at udføre dynamiske kvantitative tests i det samme laboratorium.
• Nogle tests, især genetiske tests, kan være ret dyre.
• For at udføre PCR-test kræves dyrt udstyr, reagenser og veluddannet kvalificeret personale. Nøjagtigheden af ​​analyseresultaterne afhænger af reagensernes kvalitet og metoden til at tage biologiske prøver.

For at identificere, hvilke infektioner PCR er egnet (anvendelsesområde for metoden i medicin)

PCR -metode bruges til identifikation, det vil sige den kvalitative bestemmelse, såvel som til den kvantitative bestemmelse af DNA og RNA for patogener ved forskellige infektioner:

• humant immundefektvirus (HIV);
• hepatitisvirus A, B, C, D, G;
• patogener, der forårsager sygdomme i det urogenitale område, for eksempel Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• patogener, der forårsager dysbiose i urogenitalkanalen og candidiasis, for eksempel mikroorganismer, såsom Saccharimonas aalborgensis, mikroskopiske svampe af slægten Candida;
• forårsagende midler til humane papillomavirusinfektioner;
• TORCH- og herpesvirusinfektioner;
• patogener af naturlige fokale infektioner, der kan spredes af fugle, dyr, blodsugende insekter, for eksempel borreliose, encephalitis, West Nile feber;
• gastrointestinale infektioner;
• forårsagende agenter for tuberkulose;
• luftvejsinfektioner (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• nosokomielle infektioner (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

Viral belastning bestemmes også af PCR -metoden, sygdommens dynamik og terapiens effekt undersøges.

Polymerasekædereaktionen i medicin har en anden vigtig anvendelse - det er bestemmelsen af ​​polymorfier af menneskelige gener (lokale ændringer) og mutationer. Mindre lokale ændringer i forskellige generers DNA -sekvens er årsagen til udviklingen af ​​forskellige sygdomme.

Disse sygdomme kan gå i arv. PCR -metoden giver dig mulighed for at identificere disse mutationer og forhindre udvikling eller lindre sygdomsforløbet.

PCR bruges til at opdage mutationer, der forårsager udvikling af sygdomme, såsom:

• krænkelse af blodpropper;
• hjerte -kar -sygdomme;
• metaboliske lidelser (for eksempel laktoseintolerans);
• nedsat reproduktiv funktion (mutationer, der forårsager infertilitet hos mænd);
• bryst- og æggestokkræft;
• autoimmune sygdomme.

Prøver til forskning

Afhængigt af den påviste infektionstype kan prøver til analyse være prøver af biologiske væsker, væv, epitelceller:

• blodserum / plasma, perifert, navlestrengsblod;
• prøver af slimhindeepitel (livmoderhalskanal, vagina, urinrør);
• afskrabninger af bindehinden, næsehulen, oropharynx;
• sæd, prostata sekretion;
• skrabning fra erosive og ulcerative læsioner;
• urin;
• sputum;
• afføring;
• andre biologiske væsker (fostervand, cerebrospinalvæske, fostervand, ledvæske);
• biopsimateriale i lungerne, leveren, mave -tarmkanalen;
• bronchoalveolar skylning.

Regler for levering af biologiske væsker til PCR

Polymerasekædereaktion er en metode, der kræver streng overholdelse af anbefalinger, selv på tidspunktet for indsamling af biologisk materiale.

Utilstrækkelig prøveudtagning kan føre til falske positive eller falske negative resultater.

• Hvis der kræves et særligt transportmedium til transport og opbevaring af biologisk materiale inden analyse, det anbefales at bruge en transportløsning fremstillet af det samme firma, der leverer PCR -kittene prøve.
• Prøveudtagning til PCR -test udføres separat fra prøver beregnet til andre undersøgelser. Sterile engangsinstrumenter, beholdere og handsker bruges til valg.
• Det anbefales at tage prøver til analyse inden behandlingsstart og 2 uger efter dets afslutning.
• Det anbefales at donere blod om morgenen på tom mave. Fuldblod opbevares i antikoagulantrør (EDTA, citronsyrenatrium). Andre antikoagulantia, såsom heparin, er ikke tilladt, fordi de hæmmer PCR -reaktionen. Serum opbevares uden antikoagulantia.
• Ved indsamling af urin er det nødvendigt at opsamle morgenurinen (første portion), cirka 30-40 ml. Det er tilladt at opbevare prøven, indtil den sendes til laboratoriet i højst 2 timer.
• Inden der opsamles spyt, skylles munden med saltvand. Det anbefales ikke at spise i 4 timer, før prøven opsamles. Mængden af ​​prøve er fra 3 til 5 ml. Spyt opsamles umiddelbart før analyse; materialet kan opbevares frosset ved minus 20 ° C.
• Engangsrør bruges til at opsamle sputumprøver. Det nødvendige prøvevolumen er fra 5 til 10 ml. Før analyse kan prøven opbevares i 24 timer ved 4 ° C.
• Synovialvæsken trækkes ud med en sprøjte. Det anbefales at bruge sterilt engangsudstyr til indsamling og opbevaring af materiale. Det nødvendige prøvevolumen er 1 ml.
• For at tage en prøve af slimhindernes epitel bruges prober (f.eks. Fra viskose) eller cytobrushes.

Sådan forbereder du dig på PCR -analyse

Korrekt indsamling af materiale er nødvendig for at opnå korrekte testresultater, derfor anbefales det at overholde følgende regler:

• Det anbefales at indsamle biologisk materiale under et akut infektionsforløb, men antibakterielle midler bør ikke tages på nuværende tidspunkt.
• Inden du tager prøver fra skeden, anbefales det at stoppe med at tage vaginal medicin og heller ikke at udføre procedurer som f.eks. Douching i 24 timer.
• Inden du tager en prøve fra urinrøret, skal du afstå fra at urinere i 1,5-2 timer, behandle urinrørets ydre indgang med saltvand.
• Det anbefales, at urinprøver indsamles på tom mave om morgenen.
• Inden opsamling af spyt afbrydes mad, medicin og alkohol 12 timer før prøvetagning. Inden prøven opsamles, renses mundhulen og tænderne med en tandbørste uden pasta, mundhulen skal skylles grundigt med vand uden brug af yderligere midler. Spyt opsamles med en sprøjte.
• Når du tager skraber fra oropharynx, må du ikke spise eller drikke vand i 2 timer. Det anbefales ikke at bruge halsspray, tyggegummi, pastiller eller børste tænder.
• Ved opsamling af sputum anbefales det at behandle mundhulen grundigt: børste tænder, skyl munden. Saml morgen slim eller purulent udflåd. En 3 ml prøve er tilstrækkelig til test. For at øge mængden af ​​sekret kan du tage slimløsende inhalationer eller medicin.
• En udstrygning fra øjets bindehinde tages på indersiden af ​​det nedre øjenlåg uden at røre øjenvipperne.

Swabbing procedure (for kvinder og mænd)

Ved undersøgelse af den urogenitale kanal hos kvinder udføres skrabning af vaginal slimhinde, urinrør og livmoderhalskanal. Prøver tages før manuel inspektion. Prøvetagning udføres ved hjælp af sterile prober med en vatpind eller cytobrush.

Før proceduren behandles det ydre område af urinrøret med en steril opløsning, overskydende slim fjernes fra skeden og livmoderhalsen. Sonden indsættes i urinrøret eller i livmoderhalskanalen til en dybde på 0,5-1,5 cm. Materialet opsamles med blide rotationsbevægelser.

Et udstryg tages fra bagsiden af ​​skeden. Når sonden fjernes, anbefales det ikke at røre ved skedens vægge med den.

Sonden (dens arbejdsområde) vaskes i et reagensglas med en transportvæske, som leveres af producenten af ​​et kit til PCR -diagnostik og klemmes mod reagensglasets vægge. Nogle gange anbefaler kitproducenten at bryde sonden og efterlade arbejdsdelen direkte i røret. Dette reducerer prøvetab.

Det anbefales ikke at tage udstrygninger til PCR efter kolposkopi. Inden prøveudtagning af materialet anbefales det at stoppe med at tage vaginale tabletter og lægemidler om 2-3 dage. Udstrygningen tages tidligst 2-3 dage efter menstruationens afslutning.

Når man tager en smøre fra mænd, behandles det ydre område af urinrøret med en steril opløsning, og overskydende sekretion fjernes. En steril sonde indsættes 3-4 cm for at opsamle en prøve. Arbejdsdelen af ​​sonden vaskes i et reagensglas med en transportopløsning.

Hvordan dekrypteres PCR -test

I resultaterne af PCR -testen er det ud over analysens navn og testresultaterne angivet norm eller referenceværdier, som det opnåede resultat kan sammenlignes med:

Analysens navn	Resultat	Norm
Chlamidia trachomatis DNA	Positiv	Negativ
Micoplasma hominis DNA	Negativ	Negativ

Et positivt resultat betyder tilstedeværelsen af ​​et patogen DNA i det biologiske materiale, et negativt resultat betyder dets fravær.

Ved vurdering af viral belastning kvantificeres DNA. I dette tilfælde indeholder resultattabellen den numeriske værdi af antallet af kopier af det detekterede DNA, for eksempel:

Indeks	Resultat	Referenceværdier
Kvantificering af hepatitis B -virus -DNA	4,3 * 10v 3 st.	<300 klinisk ubetydelige; > 300 positive

I tilfælde af kvalitativ og kvantitativ analyse vurderes resultaterne af den behandlende læge.

Når man analyserer de opnåede resultater, opstår der ofte følgende fejl:

• Tidlig kontrol PCR -test efter afslutningen af ​​antibiotikaforløbet (efter 1-2 uger). DNA'et fra det infektiøse middel forbliver i patientens krop i flere uger, efter at cellerne i det infektiøse middel er ødelagt ved terapi. Derfor er det opnåede positive resultat falsk positivt, og konklusionen om, at terapien ikke fungerede, er fejlagtig. Hvis vi taler om forårsagende infektionsmidler på hudepitelet, anbefales testen tidligst en måned efter behandlingens afslutning.
• Ved fortolkning af PCR -analyse af nogle infektionerfor eksempel cytomegalovirusinfektion betyder et positivt resultat ikke altid forløbet af den infektiøse proces og behovet for terapi. I kun 60% af tilfældene med et positivt PCR -resultat udvikler patienter kliniske tegn på sygdommen.
• Ved fortolkning af PCR -test for humant papillomavirus en positiv test kan fejlagtigt tolkes som årsagen til udviklingen af ​​onkologiske processer, selvom HPV-infektion i 90% af patienterne forsvinder om 6-24 måneder. Hvis resultatet er positivt, er det nødvendigt at foretage en undersøgelse af livmoderhalsens epitel og først derefter vurdere risikoen for at udvikle kræft.
• I undersøgelser af infektioner i det urogenitale område hos kvinder anbefales det ikke kun at bestemme opportunistiske infektioner, men også at sammenligne deres antal med antallet af Lactovacillus, der betragtes som hovedrepræsentanterne for den normale mikroflora i skeden. En sådan analyse giver dig mulighed for at bestemme dysbiose, korrekt fortolke resultaterne af PCR -testen og ordinere terapi.

Polymerasekædereaktion er en metode, der bruges til kvantitativt at undersøge viral og bakteriel belastning. Det skal huskes på, at for nogle infektioner er der ingen klar regulering, der giver dig mulighed for at bestemme den kliniske betydning af de opnåede resultater.

Det betyder, at fortolkningen af ​​resultaterne er subjektiv og kan være fejlagtig. Så for eksempel opportunistisk Ureaplasma, Mikoplasma, Gardnerella i mangel af klager og kliniske tegn på betændelse, kræver de ikke terapi. Urimelig ordination af terapi fører til en stigning i tilfælde af dysbiose og vaginose.

Video om PCR -analyse

PCR -diagnose af virusinfektion: forklaring af metoden: