Reazione a catena della polimerasi (PCR). Che cos'è, un metodo in microbiologia, medicina, cultura, striscio

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un moderno metodo di laboratorio per generare un gran numero di copie di singole sezioni di acidi nucleici (DNA o RNA). La PCR è utilizzata in molte aree della biologia e della medicina. Nella diagnostica medica, questo metodo viene utilizzato per determinare malattie infettive.

In biologia molecolare, lo scopo della copia può essere un pezzo di DNA per studiare la funzione di un particolare gene o altri esperimenti (clonazione di geni, introduzione di altri geni, identificazione di mutazioni). In un esame forense, il DNA viene esaminato per corrispondere al materiale genetico dei sospetti sulla scena del crimine.

Che cos'è l'analisi?

Nella diagnosi delle malattie utilizzando il metodo PCR, viene isolata una sezione specifica del DNA dell'agente infettivo nel materiale biologico del paziente. Se viene trovato questo sito, questa è una prova diretta della presenza dell'agente patogeno nel corpo del paziente.

La PCR può anche rilevare cambiamenti nel materiale genetico del paziente., che aiutano a determinare malattie congenite, cambiamenti nel sistema immunitario, predisposizione a varie malattie.

Quando si esegue l'analisi PCR, una certa parte della molecola di DNA o RNA dell'agente eziologico della malattia contenuta nel materiale biologico viene isolata dal campione con metodi speciali. Quindi questo sito viene duplicato molte volte con l'aiuto di enzimi.

Viene sintetizzata la quantità di DNA che può essere registrata visivamente. Viene copiata solo una certa parte della molecola del DNA.

La PCR richiede i seguenti componenti:

• DNA stampo (un pezzo di DNA che viene ripetutamente copiato e identificato),
• primer (molecole di DNA corto a filamento singolo appositamente sintetizzate necessarie per innescare la sintesi del DNA),
• DNA polimerasi (enzima che catalizza la reazione di polimerizzazione del DNA), deossinucleosidi trifosfati (le basi azotate sono le molecole che compongono il DNA).
• Altri componenti (ioni magnesio, soluzione tampone).

La reazione a catena della polimerasi è un metodo che richiede attrezzature speciali (amplificatore), consiste nei seguenti passaggi:

• Denaturazione del DNA stampo, in cui il DNA a doppio filamento viene scisso in due filamenti. Questa fase dura 30-40 secondi.
• L'adesione dei primer a specifiche regioni del DNA avviene entro 20-60 secondi.
• La polimerizzazione è la sintesi di nuovi filamenti di DNA utilizzando un enzima.

Dopo ripetute ripetizioni di queste fasi, viene sintetizzato il numero richiesto di copie (dopo 20 cicli, il numero di copie raggiunge più di un milione).

La registrazione del DNA del virus viene eseguita dopo l'amplificazione in un dispositivo speciale (se PCR con rilevamento in punto finale) o direttamente nell'amplificatore durante la reazione (se si utilizza la PCR in tempo reale) fluorescente metodo.

Dove posso fare il check-in, quanto costa

L'analisi PCR può essere eseguita in qualsiasi laboratorio medico accreditato per questa analisi.

Il costo del test dipende dal tipo di infezione:

Laboratorio	Infezione / costo
KDL	DNA del citomegalovirus - 230 rubli Virus dell'herpes simplex di tipo 6 DNA - 250 rubli RNA coronavirus SARS-CoV-2/1600 rubli.
emoticon	DNA del citomegalovirus - 250 rubli DNA dell'herpesvirus di tipo 6 - 240 rubli. RNA coronavirus SARS-CoV-2 - 1700 rubli.
In vitro	DNA del citomegalovirus nel sangue - 400 rubli. DNA di herpesvirus umano 1 e 2 tipi nel raschiamento delle cellule epiteliali della pelle - 570 rubli. RNA coronavirus SARS-CoV-2 - 1990 rubli.
Citylab	DNA del citomegalovirus - 240 rubli Herpesvirus umano di tipo 6 DNA - 290 rubli RNA coronavirus SARS-CoV-2 - 1800 rubli.

Varietà di PCR

La reazione a catena della polimerasi è un metodo per il quale sono stati sviluppati diversi metodi di impostazione dell'analisi.

Questi metodi sono stati progettati per ridurre il rischio di risultati falsi positivi e falsi negativi o per eseguire risultati quantitativi o analisi qualitativa, nonché per la determinazione di diversi acidi nucleici: DNA (acido desossiribonucleico) o RNA (acido ribonucleico).

Secondo il metodo per determinare i prodotti di reazione, si distinguono due tipi di PCR:

• PCR in tempo reale - l'amplificazione e il rilevamento vengono eseguiti contemporaneamente in un unico dispositivo. Con questa modifica della PCR, è possibile determinare la quantità della sequenza di DNA desiderata ad ogni ciclo di sintesi del DNA.
• PCR finale - una sorta di analisi PCR, in cui i risultati vengono registrati con il metodo della fluorescenza in un dispositivo speciale, dopo la fine della reazione a catena della polimerasi.

Nella pratica di laboratorio esistono diverse modalità di impostazione dell'analisi, quali:

• PCR a caldo. La particolarità di questo metodo è che la reazione inizia solo quando viene raggiunta una certa temperatura. I componenti della reazione (soprattutto gli enzimi) vengono bloccati e iniziano a funzionare solo a una certa temperatura. Questo metodo migliora la precisione dell'analisi. Se la miscela di reazione viene riscaldata gradualmente, c'è il rischio di formazione di sottoprodotti di reazione e, quindi, risultati di analisi imprecisi.
• Per il rilevamento di virus con un genoma a RNAad esempio, l'epatite C o il virus dell'immunodeficienza umana, viene utilizzato un metodo chiamato PCR a trascrizione inversa (RT-PCR). L'RNA del virus viene prima convertito in una molecola di DNA complementare. Il DNA risultante viene quindi utilizzato come stampo per la PCR.
• PCR multi-primer - un metodo per eseguire la reazione, in cui più sequenze di DNA vengono copiate contemporaneamente in un campione. Questo metodo consente di ridurre i materiali di consumo e ridurre il costo dell'analisi.
• Metodo PCR con tecnologia NASBA (Amplificazione basata sulla sequenza di acido nucleico) è che l'RNA del virus viene utilizzato come stampo per copiare materiale genetico. Con l'aiuto di enzimi speciali (trascrittasi, RNA polimerasi, RNasi), nel mezzo di reazione si forma il DNA complementare (cDNA), nonché un complesso di molecole di RNA e cDNA. La differenza tra questa modifica e la PCR standard è che non il DNA, ma l'RNA viene accumulato come materiale genetico. La differenza tra questo metodo e il metodo RT-PCR è che l'RNA non è solo uno stampo per la sintesi del cDNA, ma anche un prodotto di amplificazione (cioè il prodotto finale della reazione).

Le molecole di DNA vengono distrutte nel corpo per un tempo molto lungo e possono essere rilevate in un paziente anche se la terapia antivirale o antibiotica ha già funzionato. Pertanto, il metodo PCR standard non consente di valutare l'efficacia della terapia.

A differenza del DNA, le molecole di RNA possono essere isolate esclusivamente da cellule viventi o virus e, dopo la distruzione delle cellule viventi, anche la molecola di RNA viene rapidamente distrutta. Questa modifica consente di controllare l'effetto della terapia già al momento della sua attuazione.

Vantaggi e svantaggi della PCR

Rispetto ad altri metodi di laboratorio per rilevare le infezioni, il metodo PCR presenta diversi vantaggi:

• Il metodo PCR è un metodo diretto determinazione del materiale genetico di un virus o batteri in un campione. A differenza di altri metodi che determinano segni indiretti di infezione, il test PCR indica direttamente la presenza di un virus nel corpo.
• Elevata specificità del metodo, ovvero la capacità di identificare un agente patogeno specifico è associata al fatto che viene determinato materiale genetico che è unico per un determinato organismo (virus, batteri, funghi microscopici). Pertanto, la specificità di questo metodo è vicina al 100%.
• Elevata sensibilità del metodo (anch'essa vicina al 100%) è la quantità di campione che può essere determinata con questo metodo. Viene determinata anche una piccola quantità di virus o molecole batteriche nel materiale biologico. Ciò consente di identificare il portatore del virus anche prima della comparsa dei sintomi.
• Il metodo è universale per rilevare DNA/RNA di qualsiasi virus o batteri. Con l'aiuto della PCR, è possibile determinare eventuali infezioni e malattie croniche.
• Metodo di analisi veloce, la durata è di circa 4-6 ore.

Difetti:

• La reazione a catena della polimerasi è un metodo di rilevamento diretto del materiale genetico del patogeno (DNA), e non consente valutare l'efficacia della terapia, poiché la molecola di DNA non viene distrutta per lungo tempo, anche se la terapia è già lavorato.
• L'elevata sensibilità del metodo può essere il suo svantaggio. Ad esempio, dopo il completamento della terapia, la PCR rileva ancora il DNA delle cellule morte in un paziente sano, ottenendo così un risultato falso positivo.
• Diversi produttori di test PCR possono rilevare le stesse infezioni utilizzando sistemi diversi. Pertanto, i risultati della determinazione della stessa infezione nei laboratori possono differire. Si consiglia di eseguire test quantitativi dinamici nello stesso laboratorio.
• Alcuni test, in particolare i test genetici, possono essere piuttosto costosi.
• Per eseguire i test PCR sono necessarie apparecchiature costose, reagenti e personale qualificato ben addestrato. L'accuratezza dei risultati dell'analisi dipende dalla qualità dei reagenti e dal metodo di prelievo dei campioni biologici.

Per identificare quali infezioni PCR è adatta (ambito di applicazione del metodo in medicina)

Viene utilizzato il metodo PCR per l'identificazione, cioè la determinazione qualitativa, nonché per la determinazione quantitativa di DNA e RNA di agenti patogeni di varie infezioni:

• virus dell'immunodeficienza umana (HIV);
• virus dell'epatite A, B, C, D, G;
• agenti patogeni che causano malattie del tratto urogenitale, ad esempio Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• agenti patogeni che causano disbiosi del tratto urogenitale e candidosi, ad esempio microrganismi come Saccharimonas aalborgensis, funghi microscopici del genere Candida;
• agenti causali delle infezioni da papillomavirus umano;
• Infezioni da TORCIA e da Herpesvirus;
• agenti patogeni di infezioni focali naturali che possono essere trasmesse da uccelli, animali, insetti ematofagi, ad esempio borreliosi, encefalite, febbre del Nilo occidentale;
• infezioni gastrointestinali;
• agenti causali della tubercolosi;
• infezioni respiratorie (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• infezioni nosocomiali (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

Inoltre, la carica virale è determinata dal metodo PCR, vengono studiate le dinamiche della malattia e l'effetto della terapia.

La reazione a catena della polimerasi in medicina ha un'altra importante applicazione: è la determinazione dei polimorfismi dei geni umani (cambiamenti locali) e delle mutazioni. Piccoli cambiamenti locali nella sequenza del DNA di diversi geni sono la causa dello sviluppo di varie malattie.

Queste malattie possono essere ereditate. Il metodo PCR consente di identificare queste mutazioni e prevenire lo sviluppo o alleviare il decorso delle malattie.

La PCR viene utilizzata per rilevare mutazioni che causano lo sviluppo di malattie come:

• violazione della coagulazione del sangue;
• malattia cardiovascolare;
• disturbi metabolici (ad esempio, intolleranza al lattosio);
• funzione riproduttiva compromessa (mutazioni che causano infertilità maschile);
• cancro al seno e alle ovaie;
• Malattie autoimmuni.

Campioni per la ricerca

A seconda del tipo di infezione rilevata, i campioni per l'analisi possono essere campioni di fluidi biologici, tessuti, cellule epiteliali:

• siero sanguigno/plasma, periferico, sangue del cordone ombelicale;
• campioni di epitelio mucoso (canale cervicale, vagina, uretra);
• raschiature della congiuntiva, della cavità nasale, dell'orofaringe;
• sperma, secrezione prostatica;
• raschiatura da lesioni erosive e ulcerative;
• urina;
• espettorato;
• feci;
• altri fluidi biologici (liquido amniotico, liquido cerebrospinale, liquido amniotico, liquido articolare);
• materiale bioptico di polmoni, fegato, tratto gastrointestinale;
• lavaggio broncoalveolare.

Regole per l'erogazione di fluidi biologici per PCR

La reazione a catena della polimerasi è un metodo che richiede il rispetto rigoroso delle raccomandazioni anche nella fase di raccolta del materiale biologico.

Un campionamento inadeguato può portare a risultati falsi positivi o falsi negativi.

• Se è necessario un mezzo di trasporto speciale per il trasporto e la conservazione di materiale biologico prima dell'analisi, si consiglia di utilizzare una soluzione di trasporto prodotta dalla stessa azienda che fornisce i kit PCR test.
• Il campionamento per il test PCR viene effettuato separatamente dai campioni destinati ad altri studi. Per la selezione vengono utilizzati strumenti sterili monouso, contenitori e guanti.
• Si consiglia di prelevare campioni per l'analisi prima dell'inizio della terapia e 2 settimane dopo la sua fine.
• Si consiglia di donare il sangue al mattino a stomaco vuoto. Il sangue intero viene conservato in provette anticoagulanti (EDTA, acido citrico sodico). Altri anticoagulanti, come l'eparina, non sono consentiti perché inibiscono la reazione PCR. Il siero viene conservato senza anticoagulante.
• Quando si raccoglie l'urina, è necessario raccogliere l'urina del mattino (prima porzione), circa 30-40 ml. È consentito conservare il campione fino all'invio al laboratorio per non più di 2 ore.
• Prima di raccogliere la saliva, sciacquare la bocca con soluzione fisiologica. Si raccomanda di non mangiare per 4 ore prima di raccogliere il campione. La quantità di campione va da 3 a 5 ml. La saliva viene raccolta immediatamente prima dell'analisi; il materiale può essere conservato congelato a meno 20 ° C.
• Le provette monouso vengono utilizzate per raccogliere campioni di espettorato. Il volume del campione richiesto va da 5 a 10 ml. Prima dell'analisi, il campione può essere conservato a 4°C per 24 ore.
• Il liquido sinoviale viene prelevato con una siringa. Si consiglia di utilizzare attrezzature sterili monouso per la raccolta e la conservazione del materiale. Il volume del campione richiesto è 1 ml.
• Per prelevare un campione dell'epitelio delle mucose, vengono utilizzate sonde (ad esempio, da viscosa) o citospazzole.

Come prepararsi per l'analisi PCR

La corretta raccolta del materiale è necessaria per ottenere risultati di prova corretti, pertanto si raccomanda di osservare le seguenti regole:

• Si raccomanda di raccogliere materiale biologico durante un decorso acuto di infezione, ma in questo momento non devono essere assunti agenti antibatterici.
• Prima di prelevare campioni dalla vagina, si consiglia di interrompere l'assunzione di qualsiasi farmaco vaginale e anche di non eseguire procedure come la pulizia per 24 ore.
• Prima di prelevare un campione dall'uretra, è necessario astenersi dall'urinare per 1,5-2 ore, trattare l'ingresso esterno dell'uretra con soluzione salina.
• Si raccomanda di raccogliere i campioni di urina a stomaco vuoto al mattino.
• Prima di raccogliere la saliva, il cibo, i farmaci e l'alcol devono essere sospesi 12 ore prima della raccolta del campione. Prima di raccogliere il campione, la cavità orale e i denti vengono puliti con uno spazzolino da denti senza pasta, la cavità orale deve essere sciacquata accuratamente con acqua, senza l'uso di agenti aggiuntivi. La saliva viene raccolta con una siringa.
• Quando si prelevano raschiati dall'orofaringe, non mangiare o bere acqua per 2 ore. Non è consigliabile utilizzare spray per la gola, gomme da masticare, pastiglie o lavarsi i denti.
• Quando si raccoglie l'espettorato, si consiglia di elaborare a fondo la cavità orale: lavarsi i denti, sciacquarsi la bocca. Raccogliere muco mattutino o secrezione purulenta. Un campione di 3 ml è sufficiente per il test. Per aumentare il volume delle secrezioni, puoi assumere inalazioni o droghe espettoranti.
• Una macchia dalla congiuntiva dell'occhio viene presa sul lato interno della palpebra inferiore, senza toccare le ciglia.

Procedura di striscio (per donne e uomini)

Quando si esamina il tratto urogenitale nelle donne, viene eseguita la raschiatura della mucosa vaginale, dell'uretra e del canale cervicale. I campioni vengono prelevati prima dell'ispezione manuale. Il campionamento viene eseguito utilizzando sonde sterili con un tampone o un cytobrush.

Prima della procedura, l'area esterna dell'uretra viene trattata con una soluzione sterile, il muco in eccesso viene rimosso dalla vagina e dalla cervice. La sonda viene inserita nell'uretra o nel canale cervicale ad una profondità di 0,5-1,5 cm. Il materiale viene raccolto con delicati movimenti rotatori.

Viene prelevato un tampone dalla parte posteriore della vagina. Quando si rimuove la sonda, non è consigliabile toccare le pareti della vagina con essa.

La sonda (la sua area di lavoro) viene lavata in una provetta con un liquido di trasporto, fornito dal produttore di un kit per la diagnostica PCR, e schiacciata contro le pareti della provetta. A volte il produttore del kit consiglia di rompere la sonda e lasciare la parte lavorante direttamente nel tubo. Ciò riduce la perdita di campione.

Non è consigliabile eseguire strisci per la PCR dopo la colposcopia. Prima di assumere il materiale, si consiglia di interrompere l'assunzione di compresse e farmaci vaginali in 2-3 giorni. Lo striscio viene prelevato non prima di 2-3 giorni dopo la fine del flusso mestruale.

Quando si preleva uno striscio dagli uomini, la regione esterna dell'uretra viene trattata con una soluzione sterile e le secrezioni in eccesso vengono rimosse. Viene inserita una sonda sterile di 3-4 cm per raccogliere un campione. La parte operativa della sonda viene lavata in una provetta con una soluzione di trasporto.

Come vengono decifrati i test PCR?

Nei risultati del test PCR, oltre al nome dell'analisi e ai risultati del test, è indicato valori di norma o di riferimento con cui confrontare il risultato ottenuto:

Nome analisi	Risultato	Norma
Chlamidia trachomatis DNA	Positivo	Negativo
Micoplasma hominis DNA	Negativo	Negativo

Un risultato positivo indica la presenza di un DNA patogeno nel materiale biologico, un risultato negativo indica la sua assenza.

Quando si valuta la carica virale, il DNA viene quantificato. In questo caso la tabella dei risultati contiene il valore numerico del numero di copie del DNA rilevato, ad esempio:

Indice	Risultato	Valori di riferimento
Quantificazione del DNA del virus dell'epatite B	4.3 * 10v 3 punti	<300 clinicamente insignificanti; > 300 positivi

In caso di analisi qualitativa e quantitativa, i risultati sono valutati dal medico curante.

Quando si analizzano i risultati ottenuti, si riscontrano spesso i seguenti errori:

• Test PCR di controllo precoce dopo la fine del ciclo di antibiotici (dopo 1-2 settimane). Il DNA dell'agente infettivo rimane nel corpo del paziente per diverse settimane dopo che le cellule dell'agente infettivo sono state distrutte dalla terapia. Pertanto, il risultato positivo ottenuto è falso positivo e la conclusione che la terapia non ha funzionato è errata. Se stiamo parlando di agenti causali di infezione sull'epitelio cutaneo, il test è raccomandato non prima di un mese dopo la fine del trattamento.
• Quando si interpreta l'analisi PCR di alcune infezioni, ad esempio, l'infezione da citomegalovirus, un risultato positivo non significa sempre il corso del processo infettivo e la necessità di una terapia. Solo nel 60% dei casi con risultato positivo della PCR, i pazienti sviluppano segni clinici della malattia.
• Quando si interpretano i test PCR per il papillomavirus umano un test positivo può essere erroneamente interpretato come la causa dello sviluppo di processi oncologici, sebbene nel 90% dei pazienti l'infezione da HPV si risolva in 6-24 mesi. Se il risultato è positivo, è necessario condurre uno studio sull'epitelio della cervice e solo allora valutare il rischio di sviluppare il cancro.
• Negli studi sulle infezioni del tratto urogenitale nelle donne, si raccomanda non solo di determinare le infezioni opportunistiche, ma anche di confrontare il loro numero con il numero di Lactovacillus, che sono considerati i principali rappresentanti della normale microflora della vagina. Tale analisi consente di determinare la disbiosi, interpretare correttamente i risultati del test PCR e prescrivere la terapia.

La reazione a catena della polimerasi è un metodo utilizzato per studiare quantitativamente la carica virale e batterica. Va tenuto presente che per alcune infezioni non esiste una regolamentazione chiara che consenta di determinare il significato clinico dei risultati ottenuti.

Ciò significa che l'interpretazione dei risultati è soggettiva e può essere errata. Quindi, per esempio, opportunista Ureaplasma, micoplasma, Gardnerella in assenza di disturbi e segni clinici di infiammazione, non richiedono terapia. La prescrizione irragionevole della terapia porta ad un aumento dei casi di disbiosi e vaginosi.

Video sull'analisi PCR

Diagnosi PCR di infezione virale: spiegazione del metodo: