תגובת שרשרת פולימראז (PCR). מה זה, שיטה במיקרוביולוגיה, רפואה, תרבות, מריחה

תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא שיטת מעבדה מודרנית ליצירת מספר רב של עותקים של חלקים בודדים של חומצות גרעין (DNA או RNA). PCR משמש בתחומים רבים של ביולוגיה ורפואה. באבחון רפואי, שיטה זו משמשת לקביעה מחלות מדבקות.

בביולוגיה מולקולרית, מטרת ההעתקה יכולה להיות פיסת DNA לחקר תפקודו של גן מסוים או ניסויים אחרים (שיבוט גנים, הצגת גנים אחרים, זיהוי מוטציות). בבדיקה משפטית, DNA נבדק כך שיתאים לחומר הגנטי של חשודים בזירת הפשע.

מהו ניתוח?

באבחון מחלות באמצעות שיטת ה- PCR, קטע ספציפי של ה- DNA של הסוכן המדבק מבודד בחומר הביולוגי של המטופל. אם אתר זה נמצא, זוהי עדות ישירה לנוכחות הפתוגן בגוף המטופל.

PCR יכול גם לזהות שינויים בחומר הגנטי של המטופל., המסייעים לקביעת מחלות מולדות, שינויים במערכת החיסון, נטייה למחלות שונות.

בעת ביצוע ניתוח PCR, חלק מסוים במולקולת ה- DNA או ה- RNA של הסוכן הסיבתי של המחלה הכלולה בחומר הביולוגי מבודד מהמדגם בשיטות מיוחדות. ואז האתר הזה כפול פעמים רבות בעזרת אנזימים.

כמות ה- DNA מסונתזת שניתן להקליט ויזואלית. רק חלק מסוים ממולקולת ה- DNA מועתק.

PCR דורש את הרכיבים הבאים:

• תבנית DNA (פיסת DNA שמועתקת ומזוהה שוב ושוב),
• פריימרים (מולקולות דנ"א קצרות חד-גדיליות מסונתזות במיוחד הדרושות לזרז סינתזת DNA),
• פולימראז DNA (אנזים המזרז את התגובה של פילמור ה- DNA), טריוקוסוקליאוזיד טריפוספטים (בסיסים חנקניים הם המולקולות המרכיבות את ה- DNA).
• רכיבים אחרים (יוני מגנזיום, תמיסת חיץ).

תגובת שרשרת פולימראז היא שיטה הדורשת ציוד מיוחד (מגבר), היא מורכבת מהשלבים הבאים:

• דנטורציה של דנ"א התבנית, שבה הדנ"א דו-גדילי נחלק לשני גדילים. שלב זה נמשך 30-40 שניות.
• הצמדת פריימרים לאזורים ספציפיים של ה- DNA מתרחשת תוך 20-60 שניות.
• פולימריזציה היא סינתזה של קווצות DNA חדשות באמצעות אנזים.

לאחר חזרה חוזרת על שלבים אלה מסונתז מספר העותקים הנדרש (לאחר 20 מחזורים מספר העותקים מגיע ליותר ממיליון).

רישום ה- DNA של הנגיף מתבצע לאחר הגברה במכשיר מיוחד (אם PCR עם זיהוי ב נקודת סיום) או ישירות במגבר במהלך התגובה (אם משתמשים ב- PCR בזמן אמת) ניאון שיטה.

היכן אוכל לבצע צ'ק -אין, כמה זה עולה

ניתן לבצע ניתוח PCR בכל מעבדה רפואית שהוסמכה לניתוח זה.

עלות הבדיקה תלויה בסוג הזיהום:

מַעבָּדָה	זיהום / עלות
KDL	Cytomegalovirus DNA - 230 רובל DNA מסוג הרפס וירוס מסוג 6 - 250 רובל. נגיף ה- RNA SARS-CoV-2/1600 רובל.
Hemotest	Cytomegalovirus DNA - 250 רובל DNA מסוג הרפס וירוס מסוג 6 - 240 רובל. נגיף הקורונה RNA SARS-CoV-2-1700 רובל.
Invitro	Cytomegalovirus DNA בדם - 400 רובל. דנ"א של הרפס וירוס אנושי 1 ו -2 סוגים בגרידת תאי אפיתל של העור - 570 רובל. נגיף הקורונה RNA SARS-CoV-2-1990 רובל.
Citylab	Cytomegalovirus DNA - 240 רובל DNA של וירוס הרפס אנושי מסוג 6 - 290 רובל. נגיף ה- RNA SARS-CoV-2-1800 רובל.

זנים של PCR

תגובת שרשרת פולימראז היא שיטה שבגינה פותחו שיטות שונות להקמת הניתוח.

שיטות אלה נועדו להפחית את הסיכון לתוצאות חיוביות שווא ושליליות שווא, או לבצע כמותי או ניתוח איכותני, כמו גם לקביעת חומצות גרעין שונות: DNA (חומצה deoxyribonucleic) או RNA (חומצה ריבונוקלאית).

על פי השיטה לקביעת מוצרי התגובה, נבדלים שני סוגים של PCR:

• PCR בזמן אמת - הגברה וזיהוי מתבצעים במקביל במכשיר אחד. עם שינוי זה של ה- PCR, ניתן לקבוע את כמות רצף ה- DNA הרצוי בכל מחזור של סינתזת DNA.
• PCR נקודת סיום - מעין ניתוח PCR, שבו התוצאות נרשמות בשיטת הקרינה במכשיר מיוחד, לאחר סיום תגובת שרשרת הפולימראז.

בתרגול מעבדתי, ישנן דרכים שונות להגדרת הניתוח, כגון:

• PCR עם התחלה חמה. הייחודיות של שיטה זו היא שהתגובה מתחילה רק כאשר מגיעים לטמפרטורה מסוימת. רכיבי התגובה (במיוחד אנזימים) חסומים ומתחילים לעבוד רק בטמפרטורה מסוימת. שיטה זו משפרת את דיוק הניתוח. אם תערובת התגובה מתחממת בהדרגה, קיים סיכון להיווצרות תוצרי לוואי של תגובה ולכן תוצאות ניתוח לא מדויקות.
• לאיתור וירוסים בעלי גנום RNAלדוגמה, סוג הפטיטיס C או וירוס חיסוני אנושי, נעשה שימוש בשיטה הנקראת PCR (RT-PCR). RNA של הנגיף הופך לראשונה למולקולת DNA משלימה. ה- DNA שהתקבל משמש לאחר מכן כתבנית ל- PCR.
• PCR רב-פריימר - שיטה לביצוע התגובה, שבה מספר רצפי DNA מועתקים במקביל בדגימה אחת. שיטה זו מאפשרת לך לצמצם חומרים מתכלים ולהוזיל את עלות הניתוח.
• שיטת PCR באמצעות טכנולוגיית NASBA (הגברה המבוססת על רצף חומצות גרעין) היא שה- RNA של הנגיף משמש כתבנית להעתיק חומר גנטי. בעזרת אנזימים מיוחדים (טרנסקריפטאז, פולימראז RNA, RNase) נוצר במדיום התגובה DNA משלים (cDNA), כמו גם קומפלקס של מולקולות RNA ו- cDNA. ההבדל בין שינוי זה לבין PCR סטנדרטי הוא שלא DNA, אלא RNA נצבר כחומר גנטי. ההבדל בין שיטה זו לבין שיטת RT-PCR הוא ש- RNA אינו רק תבנית לסינתזת cDNA, אלא גם מוצר הגברה (כלומר התוצר הסופי של התגובה).

מולקולות DNA נהרסות בגוף למשך זמן רב מאוד וניתן לאתר אותן בחולה גם אם טיפול אנטי ויראלי או אנטיביוטי כבר עבד. לכן, שיטת ה- PCR הסטנדרטית אינה מאפשרת הערכת יעילות הטיפול.

בניגוד לדנ"א, מולקולות RNA ניתנות לבידוד אך ורק מתאים או וירוסים חיים, ולאחר השמדת תאים חיים גם מולקולת ה- RNA נהרסת במהירות. שינוי זה מאפשר לך לשלוט בהשפעת הטיפול כבר בזמן יישומו.

היתרונות והחסרונות של PCR

בהשוואה לשיטות מעבדה אחרות לאיתור זיהומים, לשיטת ה- PCR מספר יתרונות:

• שיטת PCR היא שיטה ישירה קביעת החומר הגנטי של וירוס או חיידק בדגימה. שלא כמו שיטות אחרות הקובעות סימנים עקיפים לזיהום, בדיקת ה- PCR מצביעה ישירות על הימצאות וירוס בגוף.
• ייחודיות גבוהה של השיטהכלומר היכולת לזהות פתוגן ספציפי קשורה לעובדה שנקבע חומר גנטי ייחודי לאורגניזם נתון (וירוס, חיידקים, פטרייה מיקרוסקופית). לכן הספציפיות של שיטה זו קרובה ל -100%.
• רגישות גבוהה של השיטה (קרוב גם ל 100%) היא כמות המדגם שניתן לקבוע בשיטה זו. אפילו כמות קטנה של וירוסים או מולקולות חיידקיות בחומר ביולוגי נקבעת. זה מאפשר לזהות את נשא הנגיף עוד לפני הופעת התסמינים.
• השיטה היא אוניברסלית לאיתור DNA / RNA של וירוסים כלשהם או חיידקים. בעזרת PCR אפשר לקבוע כל זיהום, כמו גם מחלות כרוניות.
• שיטת ניתוח מהירה, משך הזמן הוא כ 4-6 שעות.

פגמים:

• תגובת שרשרת הפולימראז היא שיטה לזיהוי ישיר של החומר הגנטי של הפתוגן (DNA), והיא אינה מאפשרת להעריך את יעילות הטיפול, מכיוון שמולקולת ה- DNA אינה נהרסת במשך זמן רב, גם אם הטיפול כבר קיים עבד.
• הרגישות הגבוהה של השיטה עשויה להיות חסרונה. לדוגמה, לאחר סיום הטיפול, PCR עדיין מזהה את ה- DNA של תאים מתים בחולה בריא, וכך מתקבל תוצאה חיובית כוזבת.
• יצרנים שונים של בדיקות PCR יכולים לזהות את אותם זיהומים באמצעות מערכות שונות. לכן, תוצאות קביעת אותו זיהום במעבדות עשויות להיות שונות. בדיקות כמותיות דינאמיות מומלץ לבצע באותה מעבדה.
• חלק מהבדיקות, במיוחד בדיקות גנטיות, עשויות להיות יקרות למדי.
• כדי לבצע בדיקות PCR, יש צורך בציוד יקר, ריאגנטים ואנשי מקצוע מוסמכים. דיוק תוצאות הניתוח תלוי באיכות הריאגנטים ובשיטת לקיחת דגימות ביולוגיות.

כדי לזהות אילו זיהומים PCR מתאימה (היקף יישום השיטה ברפואה)

משתמשים בשיטת PCR לזיהוי, כלומר הקביעה האיכותנית, כמו גם לקביעה כמותית של DNA ו- RNA של פתוגנים של זיהומים שונים:

• וירוס חיסוני אנושי (HIV);
• נגיפי הפטיטיס A, B, C, D, G;
• פתוגנים הגורמים למחלות במערכת האורוגניטלית, למשל, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• פתוגנים הגורמים לדיסביוזה של מערכת האורוגניטלית וקנדידיאזיס, למשל, מיקרואורגניזמים כגון Saccharimonas aalborgensis, פטריות מיקרוסקופיות מהסוג קנדידה;
• גורמים סיבתיים לזיהומים בנגיף הפפילומה האנושי;
• זיהומים ב- TORCH והרפס -וירוס;
• פתוגנים של זיהומים מוקדים טבעיים שיכולים להתפשט על ידי ציפורים, בעלי חיים, חרקים מוצצי דם, למשל, בורליוזיס, דלקת המוח, קדחת הנילוס המערבי;
• זיהומים במערכת העיכול;
• גורמים סיבתיים לשחפת;
• דלקות בדרכי הנשימה (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• זיהומים נוסוקומיאליים (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

כמו כן, העומס הנגיפי נקבע בשיטת ה- PCR, נבדקת דינמיקת המחלה והשפעת הטיפול.

לתגובת שרשרת הפולימראז ברפואה יש יישום חשוב נוסף - היא קביעת פולימורפיזם של גנים אנושיים (שינויים מקומיים) ומוטציות. שינויים מקומיים קטנים ברצף ה- DNA של גנים שונים הם הגורם להתפתחות מחלות שונות.

מחלות אלו יכולות לעבור בתורשה. שיטת ה- PCR מאפשרת לך לזהות מוטציות אלו ולמנוע התפתחות או להקל על מהלך המחלות.

PCR משמש לאיתור מוטציות הגורמות להתפתחות מחלות כגון:

• הפרה של קרישת דם;
• מחלות לב וכלי דם;
• הפרעות מטבוליות (למשל, אי סבילות ללקטוז);
• תפקוד רבייה לקוי (מוטציות הגורמות לפוריות הגבר);
• סרטן השד והשחלות;
• מחלות אוטואימוניות.

דוגמאות למחקר

בהתאם לסוג הזיהום שהתגלה, דגימות לניתוח יכולות להיות דגימות של נוזלים ביולוגיים, רקמות, תאי אפיתל:

• סרום / פלזמה בדם, דם היקפי וטבורי;
• דגימות של אפיתל רירי (תעלת צוואר הרחם, הנרתיק, השופכה);
• גירוד של הלחמית, חלל האף, oropharynx;
• זרע, הפרשת ערמונית;
• גירוד מנגעים שחיקיים וכיבים;
• שֶׁתֶן;
• כיח;
• צוֹאָה;
• נוזלים ביולוגיים אחרים (מי שפיר, נוזל שדרתי, מי שפיר, נוזל מפרקי);
• חומר ביופסיה של הריאות, הכבד, מערכת העיכול;
• שטיפה ברונכואלית.

כללים לאספקת נוזלים ביולוגיים ל- PCR

תגובת שרשרת פולימראז היא שיטה הדורשת הקפדה על המלצות גם בשלב איסוף החומר הביולוגי.

דגימה לא מספקת יכולה להוביל לתוצאות חיוביות שווא או שליליות שווא.

• אם נדרש אמצעי הובלה מיוחד להובלה ואחסון של חומר ביולוגי לפני הניתוח, מומלץ להשתמש בפתרון הובלה המיוצר על ידי אותה חברה המספקת את ערכות ה- PCR מִבְחָן.
• הדגימה לבדיקת PCR מתבצעת בנפרד מדגימות המיועדות למחקרים אחרים. מכשירים סטריליים חד פעמיים, מיכלים וכפפות משמשים לבחירה.
• מומלץ לקחת דגימות לניתוח לפני תחילת הטיפול ושבועיים לאחר סיומו.
• מומלץ לתרום דם בבוקר על בטן ריקה. דם מלא מאוחסן בצינורות נוגדי קרישה (EDTA, חומצת לימון נתרן). אסור להשתמש בנוגדי קרישה אחרים, כגון הפרין, מכיוון שהם מעכבים את תגובת ה- PCR. הסרום מאוחסן ללא נוגדי קרישה.
• בעת איסוף שתן, יש צורך לאסוף את שתן הבוקר (מנה ראשונה), כ 30-40 מ"ל. מותר לאחסן את הדגימה עד שהיא נשלחת למעבדה למשך לא יותר משעתיים.
• לפני איסוף הרוק, שטוף את הפה עם מי מלח. מומלץ לא לאכול במשך 4 שעות לפני איסוף הדגימה. כמות הדגימה היא בין 3 ל -5 מ"ל. הרוק נאסף מיד לפני הניתוח; ניתן לאחסן את החומר בהקפאה במינוס 20 ° C.
• צינורות חד פעמיות משמשות לאיסוף דגימות כיח. נפח הדגימה הנדרש הוא בין 5 ל -10 מ"ל. לפני הניתוח ניתן לאחסן את הדגימה למשך 24 שעות ב -4 מעלות צלזיוס.
• הנוזל הסינוביאלי נסוג בעזרת מזרק. מומלץ להשתמש בציוד סטרילי חד פעמי לאיסוף ואחסון חומרים. נפח הדגימה הנדרש הוא 1 מ"ל.
• כדי לקחת דגימה מהאפיתל של הריריות הריריות, נעשה שימוש בבדיקות (למשל מוויסקוזה) או ציטוברושים.

כיצד להתכונן לניתוח PCR

כדי לאסוף תוצאות בדיקה נכונות יש צורך באיסוף חומר נכון, לכן מומלץ להקפיד על הכללים הבאים:

• מומלץ לאסוף חומר ביולוגי במהלך הדבקה חריפה, אך אין ליטול סוכנים אנטיבקטריאליים בשלב זה.
• לפני לקיחת דגימות מהנרתיק, מומלץ להפסיק ליטול תרופות נרתיקיות, וגם לא לבצע הליכים כגון דאש במשך 24 שעות.
• לפני לקיחת דגימה מהשופכה, עליך להימנע מהטלת שתן במשך 1.5-2 שעות, לטפל בכניסה החיצונית של השופכה במלח.
• מומלץ לאסוף דגימות שתן בבטן ריקה בבוקר.
• לפני איסוף הרוק, מזון, תרופות ואלכוהול מופסק 12 שעות לפני איסוף הדגימות. לפני איסוף הדגימה, ניקוי חלל הפה והשיניים בעזרת מברשת שיניים ללא משחה, יש לשטוף היטב את חלל הפה במים, ללא שימוש בחומרים נוספים. הרוק נאסף בעזרת מזרק.
• כשאתה לוקח גירודים מהאופארינקס, אין לאכול או לשתות מים במשך שעתיים. לא מומלץ להשתמש בתרסיסי גרון, מסטיקים, כיסנים או לצחצח שיניים.
• בעת איסוף כיח, מומלץ לעבד היטב את חלל הפה: לצחצח שיניים, לשטוף את הפה. אסוף הפרשה רירית או מוגלתית בבוקר. דגימה של 3 מ"ל מספיקה לבדיקה. כדי להגדיל את נפח ההפרשות, אתה יכול לקחת שאיפות מכייחות או תרופות.
• כתם מלחמית העין נלקח בצד הפנימי של העפעף התחתון, מבלי לגעת בריסים.

הליך הדחה (לנשים וגברים)

כאשר בודקים את מערכת האורוגניטלית אצל נשים, מתבצעת גירוד של רירית הנרתיק, השופכה ותעלת צוואר הרחם. הדגימות נלקחות לפני בדיקה ידנית. הדגימה מתבצעת באמצעות בדיקות סטריליות עם ספוגית או ציטוברוש.

לפני ההליך, האזור החיצוני של השופכה מטופל בתמיסה סטרילית, ריר עודף מוסר מהנרתיק וצוואר הרחם. החללית מוחדרת לשופכה או לתעלת צוואר הרחם לעומק של 0.5-1.5 ס"מ. החומר נאסף בתנועות סיבוב עדינות.

ספוגית נלקחת מהחלק האחורי של הנרתיק. בעת הסרת החללית, לא מומלץ לגעת בעזרתה בקירות הנרתיק.

החללית (אזור העבודה שלה) נשטפת במבחנה עם נוזל הובלה, המסופק על ידי יצרן ערכה לאבחון PCR, ונדחס לקירות המבחנה. לפעמים יצרן הערכות ממליץ לשבור את החללית ולהשאיר את החלק הפועל ישירות בצינור. זה מקטין את אובדן המדגם.

לא מומלץ לקחת מריחות ל- PCR לאחר קולפוסקופיה. לפני דגימת החומר, מומלץ להפסיק ליטול טבליות ונרתיק תוך 2-3 ימים. המריחה נלקחת לא לפני 2-3 ימים לאחר סיום זרימת הווסת.

כאשר לוקחים מריחה מגברים, האזור החיצוני של השופכה מטופל בתמיסה סטרילית, והפרשות עודפות מוסרות. בדיקה סטרילית מוחדרת 3-4 ס"מ לאיסוף דגימה. החלק העובד של החללית נשטף במבחנה עם פתרון הובלה.

כיצד מפענחים בדיקות PCR

בתוצאות בדיקת ה- PCR, בנוסף לשם הניתוח ותוצאות הבדיקה, הוא מצוין ערכי נורמה או התייחסות שאפשר להשוות איתם את התוצאה המתקבלת:

שם הניתוח	תוֹצָאָה	נוֹרמָה
Chlamidia trachomatis DNA	חִיוּבִי	שלילי
DNA של Micoplasma hominis	שלילי	שלילי

תוצאה חיובית פירושה נוכחות של DNA פתוגני בחומר הביולוגי, תוצאה שלילית פירושה היעדרותו.

כאשר מעריכים עומס ויראלי, ה- DNA נמדד. במקרה זה, טבלת התוצאות מכילה את הערך המספרי של מספר העותקים של ה- DNA שזוהה, למשל:

אינדקס	תוֹצָאָה	ערכי התייחסות
כימות ה- DNA של וירוס הפטיטיס B	4.3 * 10v 3 st.	<300 מבחינה קלינית חסרת משמעות; > 300 חיוביים

במקרה של ניתוח איכותני וכמותי, התוצאות מוערכות על ידי הרופא המטפל.

בעת ניתוח התוצאות שהתקבלו, השגיאות הבאות נתקלות לעיתים קרובות:

• בדיקת PCR לבקרה מוקדמת לאחר סיום קורס האנטיביוטיקה (לאחר 1-2 שבועות). ה- DNA של החומר הזיהום נשאר בגוף המטופל מספר שבועות לאחר שתאי החומר הזיהום נהרסים על ידי טיפול. לכן, התוצאה החיובית המתקבלת היא חיובית שווא, והמסקנה שהטיפול לא עבד היא שגויה. אם אנחנו מדברים על גורמי זיהום על אפיתל העור, אז הבדיקה מומלצת לא לפני חודש לאחר סיום הטיפול.
• כאשר מפרשים ניתוח PCR של כמה זיהומיםלמשל, זיהום בציטומגלוס, תוצאה חיובית לא תמיד אומרת את מהלך התהליך הזיהומי והצורך בטיפול. רק ב -60% מהמקרים עם תוצאה PCR חיובית, החולים מפתחים סימנים קליניים של המחלה.
• בעת פרשנות בדיקות PCR לנגיף הפפילומה האנושי בדיקה חיובית יכולה להתפרש בטעות כגורם להתפתחות תהליכים אונקולוגיים, אם כי אצל 90% מהחולים, זיהום HPV נפתר תוך 6-24 חודשים. אם התוצאה חיובית, יש לערוך מחקר על האפיתל של צוואר הרחם, ורק לאחר מכן להעריך את הסיכון לסרטן.
• במחקרים על זיהומים במערכת האורוגניטלית בנשים, מומלץ לא רק לקבוע זיהומים אופורטוניסטיים, אלא גם להשוות את מספרם עם מספר הלקטובצילוס, הנחשבים לנציגים העיקריים של המיקרופלורה הרגילה של הנרתיק. ניתוח כזה מאפשר לך לקבוע דיסביוזה, לפרש נכון את תוצאות בדיקת ה- PCR ולרשום טיפול.

תגובת שרשרת פולימראז היא שיטה המשמשת ללימוד כמותית של עומס ויראלי וחיידקי. יש לזכור כי עבור חלק מהזיהומים אין תקנה ברורה המאפשרת לך לקבוע את המשמעות הקלינית של התוצאות המתקבלות.

המשמעות היא שפירוש התוצאות הוא סובייקטיבי ויכול להיות מוטעה. כך, למשל, אופורטוניסטי Ureaplasma, מיקופלזמה, גרדנרלה בהעדר תלונות וסימנים קליניים לדלקת, הם אינם דורשים טיפול. מרשם לא סביר של טיפול מוביל לעלייה במקרים של דיסביוזיס ווגינוזיס.

סרטון אודות ניתוח PCR

אבחון PCR של זיהום ויראלי: הסבר על השיטה: