Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR). Kas tas ir, metode mikrobioloģijā, medicīnā, kultūrā, uztriepe

Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir moderna laboratorijas metode, lai radītu lielu skaitu atsevišķu nukleīnskābju sekciju (DNS vai RNS) kopiju. PCR izmanto daudzās bioloģijas un medicīnas jomās. Medicīnas diagnostikā šo metodi izmanto, lai noteiktu infekcijas slimības.

Molekulārajā bioloģijā kopēšanas mērķis var būt DNS gabals, lai izpētītu konkrēta gēna darbību vai citi eksperimenti (gēnu klonēšana, citu gēnu ievadīšana, mutāciju identificēšana). Tiesu medicīnas ekspertīzē tiek pārbaudīta DNS, lai tā atbilstu aizdomās turēto ģenētiskajam materiālam nozieguma vietā.

Kas ir analīze?

Slimību diagnostikā izmantojot PCR metodi, pacienta bioloģiskajā materiālā tiek izolēta konkrēta infekcijas izraisītāja DNS sadaļa.

Ja šī vieta tiek atrasta, tas ir tiešs pierādījums patogēna klātbūtnei pacienta ķermenī.

PCR var noteikt arī izmaiņas pacienta ģenētiskajā materiālā., kas palīdz noteikt iedzimtas slimības, izmaiņas imūnsistēmā, noslieci uz dažādām slimībām.

Veicot PCR analīzi, noteikta daļa no slimības izraisītāja DNS vai RNS molekulas, kas atrodas bioloģiskajā materiālā, tiek izolēta no parauga ar īpašām metodēm. Tad šī vietne daudzas reizes tiek dublēta ar fermentu palīdzību.

Tiek sintezēts DNS daudzums, ko var vizuāli reģistrēt. Tiek kopēta tikai noteikta DNS molekulas daļa.

PCR ir nepieciešami šādi komponenti:

• DNS veidne (DNS gabals, kas tiek atkārtoti kopēts un identificēts),
• praimeri (speciāli sintezētas vienpavedienu īsas DNS molekulas, kas nepieciešamas DNS sintēzei),
• DNS polimerāze (enzīms, kas katalizē DNS polimerizācijas reakciju), deoksinukleozīdu trifosfāti (slāpekļa bāzes ir molekulas, kas veido DNS).
• Citas sastāvdaļas (magnija joni, buferšķīdums).

Polimerāzes ķēdes reakcija ir metode, kurai nepieciešams īpašs aprīkojums (pastiprinātājs), tā sastāv no šādām darbībām:

• Šablona DNS denaturācija, kurā divpavedienu DNS tiek sadalīta divās daļās. Šis posms ilgst 30-40 sekundes.
• Praimeru piesaiste noteiktiem DNS reģioniem notiek 20-60 sekunžu laikā.
• Polimerizācija ir jaunu DNS virkņu sintēze, izmantojot fermentu.

Pēc šo posmu atkārtotas atkārtošanas tiek sintezēts nepieciešamais kopiju skaits (pēc 20 cikliem kopiju skaits sasniedz vairāk nekā miljonu).

Vīrusa DNS reģistrēšana tiek veikta pēc amplifikācijas īpašā ierīcē (ja PCR ar noteikšanu gala punkts) vai tieši pastiprinātājā reakcijas laikā (ja tiek izmantots reālā laika PCR) fluorescējošs metode.

Kur es varu reģistrēties, cik tas maksā

PCR analīzi var veikt jebkurā medicīnas laboratorijā, kas akreditēta šai analīzei.

Pārbaudes izmaksas ir atkarīgas no infekcijas veida:

Laboratorija	Infekcija / izmaksas
KDL	Citomegalovīrusa DNS - 230 rubļi 6. tipa herpesvīrusa DNS - 250 rubļi. RNS koronavīruss SARS-CoV-2/1600 rubļu.
Hemotest	Citomegalovīrusa DNS - 250 rubļi 6. tipa herpes simplex vīrusa DNS - 240 rubļi. RNS koronavīruss SARS-CoV-2-1700 rubļu.
Invitro	Citomegalovīrusa DNS asinīs - 400 rubļu. 1. un 2. tipa cilvēka herpesvīrusa DNS ādas epitēlija šūnu skrāpēšanā - 570 rubļi. RNS koronavīruss SARS-CoV-2-1990 rubļi.
Citylab	Citomegalovīrusa DNS - 240 rubļi 6. tipa cilvēka herpes vīrusa DNS - 290 rubļi. RNS koronavīruss SARS-CoV-2-1800 rubļu.

PCR šķirnes

Polimerāzes ķēdes reakcija ir metode, kurai ir izstrādātas dažādas analīzes veikšanas metodes.

Šīs metodes tika izstrādātas, lai samazinātu kļūdaini pozitīvu un kļūdaini negatīvu rezultātu risku vai veiktu kvantitatīvu vai kvalitatīvu analīzi, kā arī dažādu nukleīnskābju noteikšanai: DNS (dezoksiribonukleīnskābe) vai RNS (ribonukleīnskābe).

Saskaņā ar reakcijas produktu noteikšanas metodi izšķir divus PCR veidus:

• Reālā laika PCR - pastiprināšana un noteikšana tiek veikta vienlaicīgi vienā ierīcē. Ar šo PCR modifikāciju ir iespējams noteikt vēlamās DNS sekvences daudzumu katrā DNS sintēzes ciklā.
• Beigu punkta PCR - sava veida PCR analīze, kuras rezultātus reģistrē ar fluorescences metodi īpašā ierīcē pēc polimerāzes ķēdes reakcijas beigām.

Laboratorijas praksē ir dažādi analīzes iestatīšanas veidi, piemēram:

• Karstās palaišanas PCR. Šīs metodes īpatnība ir tāda, ka reakcija sākas tikai tad, kad tiek sasniegta noteikta temperatūra. Reakcijas komponenti (īpaši fermenti) tiek bloķēti un sāk darboties tikai noteiktā temperatūrā. Šī metode uzlabo analīzes precizitāti. Ja reakcijas maisījumu karsē pakāpeniski, pastāv reakcijas blakusproduktu veidošanās risks un līdz ar to neprecīzi analīzes rezultāti.
• Lai atklātu vīrusus ar RNS genomupiemēram, C hepatīta tips vai cilvēka imūndeficīta vīruss, tiek izmantota metode, ko sauc par reversās transkripcijas PCR (RT-PCR). Vīrusa RNS vispirms tiek pārveidota par komplementāru DNS molekulu. Pēc tam iegūto DNS izmanto kā veidni PCR.
• Multi-primer PCR - reakcijas veikšanas metode, kurā vienā paraugā vienlaikus tiek kopētas vairākas DNS sekvences. Šī metode ļauj samazināt palīgmateriālus un samazināt analīzes izmaksas.
• PCR metode, izmantojot NASBA tehnoloģiju (Uz nukleīnskābju secību balstīta amplifikācija) nozīmē, ka vīrusa RNS tiek izmantota kā veidne ģenētiskā materiāla kopēšanai. Ar īpašu enzīmu (transkriptāzes, RNS polimerāzes, RNāzes) palīdzību reakcijas vidē tiek veidota komplementārā DNS (cDNS), kā arī RNS un cDNS molekulu komplekss. Atšķirība starp šo modifikāciju un standarta PCR ir tāda, ka nevis DNS, bet RNS tiek uzkrāta kā ģenētiskais materiāls. Atšķirība starp šo metodi un RT-PCR metodi ir tāda, ka RNS ir ne tikai veidne cDNS sintēzei, bet arī amplifikācijas produkts (tas ir, reakcijas galaprodukts).

DNS molekulas organismā tiek iznīcinātas ļoti ilgu laiku, un tās var noteikt pacientam pat tad, ja pretvīrusu vai antibiotiku terapija jau ir devusi rezultātu. Tāpēc standarta PCR metode neļauj novērtēt terapijas efektivitāti.

Atšķirībā no DNS, RNS molekulas var izolēt tikai no dzīvām šūnām vai vīrusiem, un pēc dzīvo šūnu iznīcināšanas arī RNS molekula tiek ātri iznīcināta. Šī modifikācija ļauj kontrolēt terapijas efektu jau tās īstenošanas laikā.

PCR priekšrocības un trūkumi

Salīdzinot ar citām laboratorijām infekcijas noteikšanai, PCR metodei ir vairākas priekšrocības:

• PCR metode ir tieša metode vīrusa vai baktēriju ģenētiskā materiāla noteikšana paraugā. Atšķirībā no citām metodēm, kas nosaka netiešas infekcijas pazīmes, PCR tests tieši norāda uz vīrusa klātbūtni organismā.
• Augsta metodes specifika, tas ir, spēja identificēt konkrētu patogēnu ir saistīta ar faktu, ka tiek noteikts ģenētiskais materiāls, kas ir unikāls konkrētam organismam (vīruss, baktērijas, mikroskopiskās sēnītes). Tāpēc šīs metodes specifika ir tuvu 100%.
• Metodes augsta jutība (arī tuvu 100%) ir parauga daudzums, ko var noteikt ar šo metodi. Tiek noteikts pat neliels daudzums vīrusu vai baktēriju molekulu bioloģiskajā materiālā. Tas ļauj identificēt vīrusa nesēju pat pirms simptomu parādīšanās.
• Metode ir universāla jebkura vīrusa DNS / RNS noteikšanai vai baktērijas. Ar PCR palīdzību ir iespējams noteikt jebkādas infekcijas, kā arī hroniskas slimības.
• Ātrās analīzes metode, ilgums ir aptuveni 4-6 stundas.

Trūkumi:

• Polimerāzes ķēdes reakcija ir metode patogēna ģenētiskā materiāla (DNS) tiešai noteikšanai, un tā neļauj novērtējiet terapijas efektivitāti, jo DNS molekula netiek iznīcināta ilgu laiku, pat ja terapija jau ir veikta strādāja.
• Metodes augstā jutība var būt tās trūkums. Piemēram, pēc terapijas pabeigšanas PCR joprojām nosaka mirušo šūnu DNS veselam pacientam, tādējādi iegūstot kļūdaini pozitīvu rezultātu.
• Dažādi PCR testu ražotāji var noteikt vienas un tās pašas infekcijas, izmantojot dažādas sistēmas. Tāpēc vienas un tās pašas infekcijas noteikšanas rezultāti laboratorijās var atšķirties. Dinamiskos kvantitatīvos testus ieteicams veikt tajā pašā laboratorijā.
• Daži testi, īpaši ģenētiskie testi, var būt diezgan dārgi.
• Lai veiktu PCR testus, ir nepieciešams dārgs aprīkojums, reaģenti un labi apmācīts kvalificēts personāls. Analīzes rezultātu precizitāte ir atkarīga no reaģentu kvalitātes un bioloģisko paraugu ņemšanas metodes.

Lai noteiktu, kuras infekcijas PCR ir piemērotas (metodes pielietojuma joma medicīnā)

Tiek izmantota PCR metode identificēšanai, tas ir, kvalitatīvai noteikšanai, kā arī dažādu infekciju patogēnu DNS un RNS kvantitatīvai noteikšanai:

• cilvēka imūndeficīta vīruss (HIV);
• hepatīta vīrusi A, B, C, D, G;
• patogēni, kas izraisa uroģenitālā trakta slimības, piemēram, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• patogēni, kas izraisa uroģenitālā trakta disbiozi un kandidozi, piemēram, tādi mikroorganismi kā Saccharimonas aalborgensis, Candida ģints mikroskopiskās sēnes;
• cilvēka papilomas vīrusa infekciju izraisītāji;
• TORCH un herpesvīrusu infekcijas;
• dabisko fokālo infekciju patogēni, kurus var izplatīt putni, dzīvnieki, asinssūcēji kukaiņi, piemēram, borelioze, encefalīts, Rietumnīlas drudzis;
• kuņģa -zarnu trakta infekcijas;
• tuberkulozes izraisītāji;
• elpceļu infekcijas (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• slimnīcas infekcijas (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

Tāpat vīrusu slodzi nosaka ar PCR metodi, tiek pētīta slimības dinamika un terapijas ietekme.

Polimerāzes ķēdes reakcijai medicīnā ir vēl viens svarīgs pielietojums - tā ir cilvēka gēnu polimorfismu (lokālu izmaiņu) un mutāciju noteikšana. Nelielas lokālas izmaiņas dažādu gēnu DNS secībā ir dažādu slimību attīstības cēlonis.

Šīs slimības var būt iedzimtas. PCR metode ļauj identificēt šīs mutācijas un novērst slimību attīstību vai atvieglot to gaitu.

PCR izmanto, lai noteiktu mutācijas, kas izraisa tādu slimību attīstību kā:

• asins recēšanas pārkāpums;
• sirds un asinsvadu slimības;
• vielmaiņas traucējumi (piemēram, laktozes nepanesamība);
• reproduktīvās funkcijas traucējumi (mutācijas, kas izraisa vīriešu neauglību);
• krūts un olnīcu vēzis;
• autoimūnas slimības.

Paraugi pētniecībai

Atkarībā no atklātās infekcijas veida analīzei var izmantot bioloģisko šķidrumu, audu, epitēlija šūnu paraugus:

• asins serums / plazma, perifērās, nabassaites asinis;
• gļotādas epitēlija paraugi (dzemdes kakla kanāls, maksts, urīnizvadkanāls);
• konjunktīvas, deguna dobuma, orofarneksa skrāpējumi;
• sēkla, prostatas sekrēcija;
• skrāpēšana no erozīviem un čūlainiem bojājumiem;
• urīns;
• krēpas;
• izkārnījumi;
• citi bioloģiskie šķidrumi (amnija šķidrums, cerebrospinālais šķidrums, amnija šķidrums, locītavu šķidrums);
• plaušu, aknu, kuņģa -zarnu trakta biopsijas materiāls;
• bronhu -alveolu skalošana.

Noteikumi bioloģisko šķidrumu piegādei PCR

Polimerāzes ķēdes reakcija ir metode, kas prasa stingri ievērot ieteikumus pat bioloģiskā materiāla savākšanas stadijā.

Neatbilstoša paraugu ņemšana var izraisīt kļūdaini pozitīvus vai kļūdaini negatīvus rezultātus.

• Ja bioloģiskā materiāla transportēšanai un uzglabāšanai pirms analīzes ir nepieciešama īpaša transportēšanas vide, ieteicams izmantot transporta risinājumu, ko ražojis tas pats uzņēmums, kas piegādā PCR komplektus pārbaude.
• Paraugus PCR testam ņem atsevišķi no citiem pētījumiem paredzētajiem paraugiem. Atlasei tiek izmantoti vienreiz lietojami sterili instrumenti, trauki un cimdi.
• Ieteicams ņemt paraugus analīzei pirms terapijas sākuma un 2 nedēļas pēc tās beigām.
• Asinis ziedot ieteicams no rīta tukšā dūšā. Visas asinis tiek uzglabātas antikoagulantu mēģenēs (EDTA, citronskābes nātrijs). Citi antikoagulanti, piemēram, heparīns, nav atļauti, jo tie kavē PCR reakciju. Serums tiek uzglabāts bez antikoagulantiem.
• Savācot urīnu, ir jāsavāc rīta urīns (pirmā daļa), apmēram 30-40 ml. Paraugu ir atļauts uzglabāt, līdz tas tiek nosūtīts uz laboratoriju ne ilgāk kā 2 stundas.
• Pirms siekalu savākšanas izskalojiet muti ar fizioloģisko šķīdumu. Pirms parauga savākšanas ieteicams neēst 4 stundas. Parauga daudzums ir no 3 līdz 5 ml. Siekalas tiek savāktas tieši pirms analīzes; materiālu var uzglabāt sasaldētu mīnus 20 ° C temperatūrā.
• Krēpu paraugu savākšanai izmanto vienreizējās lietošanas mēģenes. Nepieciešamais parauga tilpums ir no 5 līdz 10 ml. Pirms analīzes paraugu var uzglabāt 4 ° C temperatūrā 24 stundas.
• Sinoviālais šķidrums tiek izvilkts ar šļirci. Materiālu savākšanai un uzglabāšanai ieteicams izmantot vienreizējās lietošanas sterilu aprīkojumu. Nepieciešamais parauga tilpums ir 1 ml.
• Lai ņemtu gļotādu epitēlija paraugu, tiek izmantotas zondes (piemēram, no viskozes) vai cito birstes.

Kā sagatavoties PCR analīzei

Lai iegūtu pareizus testa rezultātus, ir nepieciešama pareiza materiālu savākšana, tāpēc ieteicams ievērot šādus noteikumus:

• Ieteicams savākt bioloģisko materiālu akūtas infekcijas laikā, bet antibakteriālos līdzekļus šajā laikā nevajadzētu lietot.
• Pirms paraugu ņemšanas no maksts ieteicams pārtraukt jebkādu maksts medikamentu lietošanu, kā arī neveikt tādas procedūras kā dušas mazgāšana 24 stundas.
• Pirms parauga ņemšanas no urīnizvadkanāla, jums vajadzētu atturēties no urinēšanas 1,5-2 stundas, apstrādāt urīnizvadkanāla ārējo ieeju ar fizioloģisko šķīdumu.
• Urīna paraugus ieteicams ņemt tukšā dūšā no rīta.
• Pirms siekalu savākšanas pārtiku, medikamentus un alkoholu pārtrauc 12 stundas pirms paraugu ņemšanas. Pirms parauga savākšanas mutes dobumu un zobus notīra ar zobu suku bez pastas, mutes dobums rūpīgi jāizskalo ar ūdeni, neizmantojot papildu līdzekļus. Siekalas tiek savāktas ar šļirci.
• Ņemot skrāpējumus no mutes dobuma, 2 stundas neēdiet un nedzeriet ūdeni. Nav ieteicams lietot rīkles aerosolus, košļājamās gumijas, pastilus vai tīrīt zobus.
• Savācot krēpu, ieteicams rūpīgi apstrādāt mutes dobumu: tīrīt zobus, izskalot muti. Savāc rīta gļotādu vai strutainu izdalījumu. Pārbaudei pietiek ar 3 ml paraugu. Lai palielinātu izdalījumu apjomu, varat lietot atkrēpošanas inhalācijas vai zāles.
• Uztriepi no acs konjunktīvas ņem apakšējā plakstiņa iekšpusē, nepieskaroties skropstām.

Notriepšanas procedūra (sievietēm un vīriešiem)

Pārbaudot uroģenitālo traktu sievietēm, tiek veikta maksts gļotādas, urīnizvadkanāla un dzemdes kakla kanāla skrāpēšana. Paraugi tiek ņemti pirms manuālas pārbaudes. Paraugu ņemšana tiek veikta, izmantojot sterilus zondes ar tamponu vai citokrotu.

Pirms procedūras urīnizvadkanāla ārējo zonu apstrādā ar sterilu šķīdumu, no maksts un dzemdes kakla noņem lieko gļotu. Zonde tiek ievietota urīnizvadkanālā vai dzemdes kakla kanālā 0,5-1,5 cm dziļumā. Materiāls tiek savākts ar maigām rotācijas kustībām.

Tamponu ņem no maksts aizmugures. Noņemot zondi, nav ieteicams ar to pieskarties maksts sienām.

Zondi (tās darba zonu) mazgā mēģenē ar transportēšanas šķidrumu, ko piegādā PCR diagnostikas komplekta ražotājs, un saspiež pret mēģenes sienām. Dažreiz komplekta ražotājs iesaka salauzt zondi un atstāt darba daļu tieši caurulē. Tas samazina paraugu zudumu.

Pēc kolposkopijas nav ieteicams veikt uztriepes PCR. Pirms materiāla lietošanas ieteicams pārtraukt maksts tablešu un zāļu lietošanu 2-3 dienu laikā. Uztriepi ņem ne agrāk kā 2-3 dienas pēc menstruācijas beigām.

Noņemot uztriepi no vīriešiem, urīnizvadkanāla ārējo daļu apstrādā ar sterilu šķīdumu un noņem lieko sekrēciju. Lai savāktu paraugu, 3-4 cm ievieto sterilu zondi. Zondes darba daļu mazgā mēģenē ar transporta šķīdumu.

Kā tiek atšifrēti PCR testi

PCR testa rezultātos papildus analīzes nosaukumam un testa rezultātiem ir norādīts norma vai atsauces vērtības, ar kurām var salīdzināt iegūto rezultātu:

Analīzes nosaukums	Rezultāts	Norm
Chlamidia trachomatis DNS	Pozitīvs	Negatīvs
Mikoplazmas hominis DNS	Negatīvs	Negatīvs

Pozitīvs rezultāts nozīmē patogēna DNS klātbūtni bioloģiskajā materiālā, negatīvs - tā neesamību.

Novērtējot vīrusu slodzi, tiek noteikta DNS. Šajā gadījumā rezultātu tabulā ir konstatētās DNS kopiju skaita skaitliskā vērtība, piemēram:

Indekss	Rezultāts	Atsauces vērtības
B hepatīta vīrusa DNS noteikšana	4,3 * 10V 3 st.	<300 klīniski nenozīmīgi; > 300 pozitīvi

Kvalitatīvas un kvantitatīvas analīzes gadījumā rezultātus novērtē ārstējošais ārsts.

Analizējot iegūtos rezultātus, bieži rodas šādas kļūdas:

• Agrīnas kontroles PCR tests pēc antibiotiku kursa beigām (pēc 1-2 nedēļām). Infekcijas izraisītāja DNS paliek pacienta ķermenī vairākas nedēļas pēc tam, kad infekcijas izraisītāja šūnas tiek iznīcinātas ar terapiju. Tāpēc iegūtais pozitīvais rezultāts ir kļūdaini pozitīvs, un secinājums, ka terapija nedarbojās, ir kļūdains. Ja mēs runājam par infekcijas izraisītājiem uz ādas epitēlija, tad testu ieteicams veikt ne agrāk kā mēnesi pēc ārstēšanas beigām.
• Interpretējot dažu infekciju PCR analīzi, piemēram, citomegalovīrusa infekcija, pozitīvs rezultāts ne vienmēr nozīmē infekcijas procesa gaitu un terapijas nepieciešamību. Tikai 60% gadījumu ar pozitīvu PCR rezultātu pacientiem rodas slimības klīniskās pazīmes.
• Interpretējot PCR testus cilvēka papilomas vīrusam pozitīvu testu var kļūdaini interpretēt kā onkoloģisko procesu attīstības cēloni, lai gan 90% pacientu HPV infekcija izzūd 6-24 mēnešu laikā. Ja rezultāts ir pozitīvs, ir nepieciešams veikt dzemdes kakla epitēlija pētījumu un tikai pēc tam novērtēt vēža risku.
• Pētījumos par uroģenitālā trakta infekcijām sievietēm ieteicams ne tikai noteikt oportūnistiskas infekcijas, bet arī salīdzināt to skaitu ar Lactovacillus skaitu, kas tiek uzskatīti par maksts normālās mikrofloras galvenajiem pārstāvjiem. Šāda analīze ļauj noteikt disbiozi, pareizi interpretēt PCR testa rezultātus un izrakstīt terapiju.

Polimerāzes ķēdes reakcija ir metode, ko izmanto vīrusu un baktēriju slodzes noteikšanai. Jāpatur prātā, ka dažām infekcijām nav skaidra regulējuma, kas ļautu noteikt iegūto rezultātu klīnisko nozīmi.

Tas nozīmē, ka rezultātu interpretācija ir subjektīva un var būt kļūdaina. Tā, piemēram, oportūnistiski Ureaplazma, Mikoplazma, Gardnerella ja nav sūdzību un iekaisuma klīnisko pazīmju, tiem nav nepieciešama terapija. Nepamatota terapijas izrakstīšana palielina disbiozes un vaginozes gadījumu skaitu.

Video par PCR analīzi

Vīrusu infekcijas PCR diagnostika: metodes skaidrojums: