Reacția în lanț a polimerazei (PCR). Ce este, o metodă în microbiologie, medicină, cultură, frotiu

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o metodă modernă de laborator pentru generarea unui număr mare de copii ale secțiunilor individuale ale acizilor nucleici (ADN sau ARN). PCR este utilizat în multe domenii ale biologiei și medicinei. În diagnosticul medical, această metodă este utilizată pentru a determina boli infecțioase.

În biologia moleculară, scopul copierii poate fi o bucată de ADN pentru a studia funcția unei anumite gene sau a altor experimente (clonarea genelor, introducerea altor gene, identificarea mutațiilor). În cadrul unei examinări criminalistice, ADN-ul este examinat pentru a se potrivi cu materialul genetic al suspecților de la locul faptei.

Ce este analiza?

În diagnosticul bolilor folosind metoda PCR, o secțiune specifică a ADN-ului agentului infecțios este izolată în materialul biologic al pacientului. Dacă se găsește acest site, aceasta este o dovadă directă a prezenței agentului patogen în corpul pacientului.

PCR poate detecta, de asemenea, modificări ale materialului genetic al pacientului., care ajută la determinarea bolilor congenitale, modificări ale sistemului imunitar, predispoziție la diferite boli.

La efectuarea analizei PCR, o anumită parte a moleculei de ADN sau ARN a agentului cauzal al bolii conținut în materialul biologic este izolată din probă prin metode speciale. Apoi, acest site este duplicat de multe ori cu ajutorul enzimelor.

Se sintetizează cantitatea de ADN care poate fi înregistrată vizual. Doar o anumită parte a moleculei de ADN este copiată.

PCR necesită următoarele componente:

• Șablon ADN (o bucată de ADN care este copiată și identificată în mod repetat),
• primeri (molecule de ADN scurte monocatenare special sintetizate necesare pentru însămânțarea sintezei ADN),
• ADN polimeraza (o enzimă care catalizează reacția polimerizării ADN), trifosfații deoxinucleozidici (bazele azotate sunt moleculele care alcătuiesc ADN-ul).
• Alte componente (ioni de magneziu, soluție tampon).

Reacția în lanț a polimerazei este o metodă care necesită echipamente speciale (amplificator), constă din următorii pași:

• Denaturarea ADN-ului șablon, în care ADN bicatenar este divizat în două catene. Această etapă durează 30-40 de secunde.
• Atașarea primerilor la anumite regiuni ale ADN are loc în 20-60 de secunde.
• Polimerizarea este sinteza de noi catene de ADN folosind o enzimă.

După repetarea repetată a acestor etape, se sintetizează numărul necesar de copii (după 20 de cicluri, numărul de copii ajunge la mai mult de un milion).

Înregistrarea ADN-ului virusului se efectuează după amplificare într-un dispozitiv special (dacă PCR cu detectare în punctul final) sau direct în amplificator în timpul reacției (dacă se utilizează PCR în timp real) fluorescentă metodă.

Unde pot face check-in, cât costă

Analiza PCR se poate face în orice laborator medical acreditat pentru această analiză.

Costul testului depinde de tipul de infecție:

Laborator	Infecție / cost
KDL	ADN citomegalovirus - 230 ruble ADN-ul herpesvirusului de tip 6 - 250 de ruble. ARN coronavirus SARS-CoV-2/1600 ruble.
Hemotest	ADN citomegalovirus - 250 ruble ADN-ul herpesvirusului de tip 6 - 240 ruble. ARN coronavirus SARS-CoV-2 - 1700 ruble.
In vitro	ADN-ul citomegalovirusului în sânge - 400 de ruble. ADN-ul herpesvirusului 1 și 2 tipuri în răzuirea celulelor epiteliale ale pielii - 570 ruble. ARN coronavirus SARS-CoV-2 - 1990 ruble.
Citylab	ADN citomegalovirus - 240 ruble ADN-ul virusului herpes uman tip 6 - 290 ruble. ARN coronavirus SARS-CoV-2 - 1800 ruble.

Soiuri de PCR

Reacția în lanț a polimerazei este o metodă pentru care au fost dezvoltate diferite metode de configurare a analizei.

Aceste metode au fost concepute pentru a reduce riscul de rezultate fals pozitive și false negative sau pentru a efectua cantitativ sau analiza calitativă, precum și pentru determinarea diferiților acizi nucleici: ADN (acid dezoxiribonucleic) sau ARN (acid ribonucleic).

Conform metodei de determinare a produselor de reacție, se disting două tipuri de PCR:

• PCR în timp real - amplificarea și detectarea se efectuează simultan într-un singur dispozitiv. Cu această modificare a PCR, este posibil să se determine cantitatea de secvență de ADN dorită la fiecare ciclu de sinteză a ADN-ului.
• PCR de punct final - un fel de analiză PCR, în care rezultatele sunt înregistrate prin metoda fluorescenței într-un dispozitiv special, după încheierea reacției în lanț a polimerazei.

În practica de laborator, există diferite moduri de configurare a analizei, cum ar fi:

• PCR pornit la cald. Particularitatea acestei metode este că reacția începe doar când se atinge o anumită temperatură. Componentele reacției (în special enzimele) sunt blocate și încep să funcționeze numai la o anumită temperatură. Această metodă îmbunătățește precizia analizei. Dacă amestecul de reacție este încălzit treptat, există riscul formării subproduselor de reacție și, prin urmare, rezultă analize inexacte.
• Pentru detectarea virușilor cu genom ARNde exemplu, virusul hepatitei C sau virusul imunodeficienței umane, se utilizează o metodă numită transcripție inversă PCR (RT-PCR). ARN-ul virusului este transformat mai întâi într-o moleculă de ADN complementară. ADN-ul rezultat este apoi utilizat ca șablon pentru PCR.
• PCR multi-primer - o metodă de realizare a reacției, în care mai multe secvențe de ADN sunt copiate simultan într-o probă. Această metodă vă permite să reduceți consumabilele și să reduceți costul analizei.
• Metoda PCR utilizând tehnologia NASBA (Amplificarea pe bază de secvență a acidului nucleic) este că ARN-ul virusului este folosit ca șablon pentru copierea materialului genetic. Cu ajutorul unor enzime speciale (transcriptază, ARN polimerază, ARNază), se formează ADN complementar (ADNc) în mediul de reacție, precum și un complex de molecule de ARN și ADNc. Diferența dintre această modificare și PCR standard este că nu ADN-ul, ci ARN-ul se acumulează ca material genetic. Diferența dintre această metodă și metoda RT-PCR este că ARN nu este doar un șablon pentru sinteza ADNc, ci și un produs de amplificare (adică produsul final al reacției).

Moleculele de ADN sunt distruse în organism pentru o perioadă foarte lungă de timp și pot fi detectate la un pacient chiar dacă terapia antivirală sau cu antibiotice a funcționat deja. Prin urmare, metoda standard PCR nu permite evaluarea eficacității terapiei.

Spre deosebire de ADN, moleculele de ARN pot fi izolate exclusiv din celulele vii sau viruși, iar după distrugerea celulelor vii, molecula de ARN este, de asemenea, distrusă rapid. Această modificare vă permite să controlați efectul terapiei deja în momentul implementării sale.

Avantajele și dezavantajele PCR

Comparativ cu alte metode de laborator pentru detectarea infecțiilor, metoda PCR are mai multe avantaje:

• Metoda PCR este o metodă directă determinarea materialului genetic al unui virus sau bacterie dintr-o probă. Spre deosebire de alte metode care determină semnele indirecte de infecție, testul PCR indică direct prezența unui virus în organism.
• Specificitate ridicată a metodei, adică capacitatea de a identifica un agent patogen specific este asociată cu faptul că se determină materialul genetic care este unic pentru un anumit organism (virus, bacterii, ciuperci microscopice). Prin urmare, specificitatea acestei metode este aproape de 100%.
• Sensibilitate ridicată a metodei (de asemenea, aproape de 100%) este cantitatea de probă care poate fi determinată prin această metodă. Chiar și o cantitate mică de virus sau molecule bacteriene din materialul biologic este determinată. Acest lucru face posibilă identificarea purtătorului virusului chiar înainte de apariția simptomelor.
• Metoda este universală pentru detectarea ADN-ului / ARN-ului oricărui virus sau bacterii. Cu ajutorul PCR, este posibil să se determine orice infecții, precum și boli cronice.
• Metoda de analiză rapidă, durata este de aproximativ 4-6 ore.

Defecte:

• Reacția în lanț a polimerazei este o metodă de detectare directă a materialului genetic (ADN) al agentului patogen și nu permite evaluați eficacitatea terapiei, deoarece molecula de ADN nu este distrusă mult timp, chiar dacă terapia este deja a lucrat.
• Sensibilitatea ridicată a metodei poate fi dezavantajul acesteia. De exemplu, după finalizarea terapiei, PCR încă detectează ADN-ul celulelor moarte la un pacient sănătos, obținând astfel un rezultat fals pozitiv.
• Diferiti producatori de teste PCR pot detecta aceleasi infectii folosind sisteme diferite. Prin urmare, rezultatele determinării aceleiași infecții în laboratoare pot diferi. Se recomandă efectuarea testelor cantitative dinamice în același laborator.
• Unele teste, în special testele genetice, pot fi destul de scumpe.
• Pentru efectuarea testelor PCR, sunt necesare echipamente scumpe, reactivi și personal calificat bine instruit. Acuratețea rezultatelor analizei depinde de calitatea reactivilor și de metoda de prelevare a probelor biologice.

Pentru a identifica ce infecții PCR este adecvată (domeniul de aplicare al metodei în medicină)

Se utilizează metoda PCR pentru identificarea, adică determinarea calitativă, precum și pentru determinarea cantitativă a ADN-ului și ARN-ului agenților patogeni ai diferitelor infecții:

• virusul imunodeficienței umane (HIV);
• virusurile hepatitei A, B, C, D, G;
• agenți patogeni care cauzează boli ale tractului urogenital, de exemplu, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• agenți patogeni care cauzează disbioză a tractului urogenital și candidoză, de exemplu, microorganisme precum Saccharimonas aalborgensis, ciuperci microscopice din genul Candida;
• agenți cauzali ai infecțiilor cu papilomavirus uman;
• TORCH și infecții cu Herpesvirus;
• agenți patogeni ai infecțiilor focale naturale care pot fi răspândite de păsări, animale, insecte care suge sânge, de exemplu, borrelioza, encefalita, febra Nilului de Vest;
• infecții gastro-intestinale;
• agenți cauzali ai tuberculozei;
• infecții respiratorii (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• infecții nosocomiale (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

De asemenea, încărcătura virală este determinată de metoda PCR, sunt investigate dinamica bolii și efectul terapiei.

Reacția în lanț a polimerazei în medicină are o altă aplicație importantă - este determinarea polimorfismelor genelor umane (modificări locale) și a mutațiilor. Modificările locale minore în secvența ADN a diferitelor gene sunt cauza dezvoltării diferitelor boli.

Aceste boli pot fi moștenite. Metoda PCR vă permite să identificați aceste mutații și să preveniți dezvoltarea sau să atenuați evoluția bolilor.

PCR este utilizat pentru a detecta mutații care determină dezvoltarea unor boli precum:

• încălcarea coagulării sângelui;
• boli cardiovasculare;
• tulburări metabolice (de exemplu, intoleranță la lactoză);
• funcția reproductivă afectată (mutații care provoacă infertilitate masculină);
• cancer mamar și ovarian;
• boală autoimună.

Mostre pentru cercetare

În funcție de tipul de infecție detectat, probele pentru analiză pot fi probe de fluide biologice, țesuturi, celule epiteliale:

• ser / plasmă de sânge, sânge periferic, din cordonul ombilical;
• probe de epiteliu mucosal (canal cervical, vagin, uretra);
• zgârieturi ale conjunctivei, cavității nazale, orofaringelui;
• spermă, secreție de prostată;
• răzuirea de la leziunile erozive și ulcerative;
• urină;
• spută;
• fecale;
• alte fluide biologice (amniotic, lichid cefalorahidian, lichid amniotic, lichid articular);
• material de biopsie al plămânilor, ficatului, tractului gastro-intestinal;
• spălarea bronhoalveolară.

Reguli pentru administrarea fluidelor biologice pentru PCR

Reacția în lanț a polimerazei este o metodă care necesită respectarea strictă a recomandărilor chiar și în etapa de colectare a materialului biologic.

Eșantionarea inadecvată poate duce la rezultate fals pozitive sau fals negative.

• Dacă este necesar un mediu de transport special pentru transportul și depozitarea materialului biologic înainte de analiză, se recomandă utilizarea unei soluții de transport fabricată de aceeași companie care furnizează kiturile PCR Test.
• Eșantionarea pentru testul PCR se efectuează separat de eșantioanele destinate altor studii. Pentru selectare se folosesc instrumente, recipiente și mănuși sterile de unică folosință.
• Se recomandă prelevarea probelor pentru analiză înainte de începerea terapiei și la 2 săptămâni după terminarea acesteia.
• Se recomandă donarea de sânge dimineața pe stomacul gol. Sângele integral este stocat în tuburi anticoagulante (EDTA, sare de sodiu a acidului citric). Alte anticoagulante, cum ar fi heparina, nu sunt permise deoarece inhibă reacția PCR. Serul se păstrează fără anticoagulant.
• Când colectați urină, este necesar să colectați urina de dimineață (prima porție), aproximativ 30-40 ml. Este permisă păstrarea probei până când este trimisă la laborator timp de cel mult 2 ore.
• Înainte de a colecta saliva, clătiți gura cu soluție salină. Se recomandă să nu mâncați timp de 4 ore înainte de colectarea probei. Cantitatea de probă este de la 3 la 5 ml. Saliva este colectată imediat înainte de analiză; materialul poate fi depozitat congelat la minus 20 ° C.
• Tuburile de unică folosință sunt folosite pentru colectarea probelor de spută. Volumul necesar de eșantion este de la 5 la 10 ml. Înainte de analiză, proba poate fi păstrată 24 de ore la 4 ° C.
• Lichidul sinovial este extras cu o seringă. Se recomandă utilizarea echipamentului steril de unică folosință pentru colectarea și depozitarea materialului. Volumul necesar de probă este de 1 ml.
• Pentru prelevarea unui eșantion de epiteliu al membranelor mucoase, se utilizează sonde (de exemplu, din viscoză) sau citobusuri.

Cum să vă pregătiți pentru analiza PCR

Colectarea corectă a materialului este necesară pentru a obține rezultatele corecte ale testului, de aceea se recomandă respectarea următoarelor reguli:

• Se recomandă colectarea materialului biologic în timpul unui curs acut de infecție, dar agenții antibacterieni nu trebuie luați în acest moment.
• Înainte de a lua probe din vagin, se recomandă să opriți administrarea oricărui medicament vaginal și, de asemenea, să nu efectuați proceduri precum dușarea timp de 24 de ore.
• Înainte de a lua o probă din uretra, trebuie să vă abțineți de la urinare timp de 1,5-2 ore, tratați intrarea externă a uretrei cu soluție salină.
• Se recomandă ca probele de urină să fie colectate pe stomacul gol dimineața.
• Înainte de colectarea salivei, alimentele, medicamentele și alcoolul sunt întrerupte cu 12 ore înainte de recoltarea probei. Înainte de colectarea probei, cavitatea bucală și dinții sunt curățați cu o periuță de dinți fără pastă, cavitatea bucală trebuie clătită bine cu apă, fără a utiliza agenți suplimentari. Saliva se colectează cu o seringă.
• Când luați resturi din orofaringe, nu mâncați și nu beți apă timp de 2 ore. Nu este recomandat să folosiți spray-uri pentru gât, gume de mestecat, pastile sau să vă spălați dinții.
• Când colectați spută, se recomandă prelucrarea temeinică a cavității bucale: spălați-vă dinții, clătiți-vă gura. Colectați descărcarea mucoasă sau purulentă de dimineață. O probă de 3 ml este suficientă pentru testare. Pentru a crește volumul de secreții, puteți lua inhalări expectorante sau medicamente.
• Un frotiu din conjunctiva ochiului este luat pe partea interioară a pleoapei inferioare, fără a atinge genele.

Procedura de luare a frotiului (pentru femei și bărbați)

La examinarea tractului urogenital la femei, se efectuează răzuirea mucoasei vaginale, a uretrei și a canalului cervical. Probele sunt prelevate înainte de inspecția manuală. Prelevarea se efectuează folosind sonde sterile cu tampon sau citobrush.

Înainte de procedură, zona exterioară a uretrei este tratată cu o soluție sterilă, excesul de mucus este îndepărtat din vagin și colul uterin. Sonda este introdusă în uretra sau în canalul cervical la o adâncime de 0,5-1,5 cm. Materialul este colectat cu mișcări de rotație ușoare.

Un frotiu este luat din spatele vaginului. Când scoateți sonda, nu este recomandat să atingeți pereții vaginului cu ea.

Sonda (zona sa de lucru) este spălată într-o eprubetă cu un lichid de transport, care este furnizat de producătorul unui kit pentru diagnosticarea PCR și este strânsă pe pereții eprubetei. Uneori, producătorul kitului recomandă ruperea sondei și lăsarea părții de lucru direct în tub. Acest lucru reduce pierderea eșantionului.

Nu este recomandat să luați frotiuri pentru PCR după colposcopie. Înainte de a lua materialul, se recomandă oprirea administrării comprimatelor și medicamentelor vaginale în 2-3 zile. Frotiul se ia nu mai devreme de 2-3 zile după sfârșitul fluxului menstrual.

Când luați un frotiu de la bărbați, regiunea exterioară a uretrei este tratată cu o soluție sterilă și excesul de secreții este eliminat. Se introduce o sondă sterilă de 3-4 cm pentru a colecta o probă. Partea de lucru a sondei este spălată într-o eprubetă cu o soluție de transport.

Cum sunt descifrate testele PCR

În rezultatele testului PCR, pe lângă numele analizei și rezultatele testului, este indicat normă sau valori de referință cu care se poate compara rezultatul obținut:

Numele analizei	Rezultat	Normă
ADN Chlamidia trachomatis	Pozitiv	Negativ
Micoplasma hominis ADN	Negativ	Negativ

Un rezultat pozitiv înseamnă prezența unui ADN patogen în materialul biologic, un rezultat negativ înseamnă absența acestuia.

La evaluarea încărcăturii virale, ADN-ul este cuantificat. În acest caz, tabelul de rezultate conține valoarea numerică a numărului de copii ale ADN-ului detectat, de exemplu:

Index	Rezultat	Valori de referinta
Cuantificarea ADN-ului virusului hepatitei B	4,3 * 10v 3 st.	<300 clinic nesemnificativ; > 300 pozitive

În cazul analizei calitative și cantitative, rezultatele sunt evaluate de medicul curant.

Când se analizează rezultatele obținute, sunt adesea întâlnite următoarele erori:

• Test de control PCR timpuriu după sfârșitul cursului de antibiotice (după 1-2 săptămâni). ADN-ul agentului infecțios rămâne în corpul pacientului câteva săptămâni după ce celulele agentului infecțios sunt distruse prin terapie. Prin urmare, rezultatul pozitiv obținut este fals pozitiv, iar concluzia că terapia nu a funcționat este eronată. Dacă vorbim despre agenții cauzali ai infecției pe epiteliul pielii, atunci se recomandă efectuarea testului nu mai devreme de o lună după terminarea tratamentului.
• La interpretarea analizei PCR a unor infecții, de exemplu, infecția cu citomegalovirus, un rezultat pozitiv nu înseamnă întotdeauna evoluția procesului infecțios și necesitatea terapiei. În doar 60% din cazuri cu un rezultat PCR pozitiv, pacienții dezvoltă semne clinice ale bolii.
• La interpretarea testelor PCR pentru virusul papilomului uman un test pozitiv poate fi interpretat în mod eronat ca fiind cauza dezvoltării proceselor oncologice, deși la 90% dintre pacienți, infecția cu HPV se rezolvă în 6-24 de luni. Dacă rezultatul este pozitiv, este necesar să se efectueze un studiu al epiteliului colului uterin și numai atunci să se evalueze riscul de cancer.
• În studiile privind infecțiile tractului urogenital la femei, se recomandă nu numai determinarea infecțiilor oportuniste, ci și compararea numărului acestora cu numărul de Lactovacillus, care sunt considerați principalii reprezentanți ai microflorei normale a vaginului. O astfel de analiză vă permite să determinați disbioza, să interpretați corect rezultatele testului PCR și să prescrieți terapia.

Reacția în lanț a polimerazei este o metodă utilizată pentru a cuantifica încărcătura virală și bacteriană. Trebuie avut în vedere faptul că pentru unele infecții nu există o reglementare clară care să vă permită să determinați semnificația clinică a rezultatelor obținute.

Aceasta înseamnă că interpretarea rezultatelor este subiectivă și poate fi eronată. Deci, de exemplu, oportunist Ureaplasma, Micoplasma, Gardnerella în absența plângerilor și a semnelor clinice de inflamație, acestea nu necesită terapie. Prescrierea nerezonabilă a terapiei duce la o creștere a cazurilor de disbioză și vaginoză.

Video despre analiza PCR

Diagnosticul PCR al infecției virale: explicația metodei: