Polymerázová řetězová reakce (PCR). Co to je, metoda v mikrobiologii, medicíně, kultuře, stěru

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je moderní laboratorní metoda pro generování velkého počtu kopií jednotlivých sekcí nukleových kyselin (DNA nebo RNA). PCR se používá v mnoha oblastech biologie a medicíny. V lékařské diagnostice se tato metoda používá ke stanovení infekční choroby.

V molekulární biologii může být účelem kopírování kus DNA ke studiu funkce konkrétního genu nebo jiné experimenty (klonování genů, zavedení jiných genů, identifikace mutací). Při forenzním zkoumání se zkoumá DNA, aby odpovídala genetickému materiálu podezřelých na místě činu.

Co je analýza?

V diagnostice nemocí pomocí metody PCR je v biologickém materiálu pacienta izolován konkrétní úsek DNA infekčního agens.

Pokud je toto místo nalezeno, je to přímý důkaz přítomnosti patogenu v těle pacienta.

PCR může také detekovat změny v genetickém materiálu pacienta., Který pomůže určit kongenitální onemocnění, změny v imunitním systému, náchylnost k různým nemocem.

Při provádění analýzy PCR je určitá část molekuly DNA nebo RNA původce onemocnění obsažená v biologickém materiálu izolována ze vzorku speciálními metodami. Pak je tato stránka duplikovány mnohokrát pomocí enzymů.

Je syntetizováno množství DNA, které lze vizuálně zaznamenat. Zkopírována je pouze určitá část molekuly DNA.

PCR vyžaduje následující komponenty:

• DNA template (kus DNA, který je opakovaně kopírován a identifikován),
• primery (speciálně syntetizované jednovláknové krátké molekuly DNA nezbytné pro iniciaci syntézy DNA),
• DNA polymeráza (enzym, který katalyzuje reakci polymerace DNA), deoxynukleosid trifosfáty (dusíkaté báze jsou molekuly, které tvoří DNA).
• Další složky (ionty hořčíku, roztok pufru).

Polymerázová řetězová reakce je metoda, která vyžaduje speciální vybavení (zesilovač), sestává z následujících kroků:

• Denaturace templátové DNA, při které se dvouvláknová DNA štěpí na dvě vlákna. Tato fáze trvá 30-40 sekund.
• K připojení primerů ke specifickým oblastem DNA dochází během 20-60 sekund.
• Polymerizace je syntéza nových řetězců DNA pomocí enzymu.

Po opakovaném opakování těchto fází se syntetizuje požadovaný počet kopií (po 20 cyklech počet kopií dosáhne více než milionu).

Registrace virové DNA se provádí po amplifikaci ve speciálním zařízení (pokud se používá PCR s detekcí v koncový bod) nebo přímo v zesilovači během reakce (pokud se používá PCR v reálném čase) fluorescenční metoda.

Kde se mohu přihlásit, kolik to stojí

Analýzu PCR lze provést v jakékoli lékařské laboratoři akreditované pro tuto analýzu.

Náklady na test závisí na typu infekce:

Laboratoř	Infekce / náklady
KDL	DNA cytomegaloviru - 230 rublů Virus herpes simplex typu 6 DNA - 250 rublů RNA koronavirus SARS-CoV-2/1600 rublů.
Hemotest	DNA cytomegaloviru - 250 rublů DNA typu herpesvirus 6 - 240 rublů. RNA koronavirus SARS-CoV-2-1700 rublů.
Invitro	DNA cytomegaloviru v krvi - 400 rublů. DNA lidského herpesviru 1 a 2 typů při škrábání epiteliálních buněk kůže - 570 rublů. RNA koronavirus SARS-CoV-2-1990 rublů.
Citylab	DNA cytomegaloviru - 240 rublů DNA lidského herpes viru typu 6 - 290 rublů. RNA koronavirus SARS-CoV-2-1 800 rublů.

Odrůdy PCR

Polymerázová řetězová reakce je způsob, pro které byly vyvinuty různé metody nastavení analýzy.

Tyto metody byly navrženy tak, aby se snížilo riziko falešně pozitivních a falešně negativních výsledků, nebo provést kvantitativní nebo kvalitativní analýza, jakož i pro stanovení různých nukleových kyselin: DNA (deoxyribonukleová kyselina) nebo RNA (ribonukleová kyselina).

V souladu se způsobem pro stanovení reakční produkty jsou charakterizovány dva typy PCR:

• PCR v reálném čase - zesílení a detekce se provádějí současně v jednom zařízení. S touto modifikací PCR je možné určit množství požadované sekvence DNA v každém cyklu syntézy DNA.
• End-point PCR - druh PCR analýzy, ve které jsou výsledky zaznamenány metodou fluorescence ve speciálním zařízení, po ukončení polymerázové řetězové reakce.

V laboratorní praxi existují různé způsoby nastavení analýzy, například:

• Hot-start PCR. Zvláštností této metody je, že reakce začíná až při dosažení určité teploty. Složky reakce (zejména enzymy) jsou blokovány a začínají pracovat pouze při určité teplotě. Tato metoda zlepšuje přesnost analýzy. Pokud se reakční směs zahřívá postupně, existuje riziko tvorby vedlejších reakčních produktů, a proto nepřesné výsledky analýzy.
• Pro detekci virů s genomem RNAnapříklad se používá typ hepatitidy C nebo virus lidské imunodeficience, metoda zvaná reverzní transkripční PCR (RT-PCR). RNA viru se nejprve převede na komplementární molekulu DNA. Výsledná DNA se poté použije jako templát pro PCR.
• PCR s více primery - způsob provádění reakce, při kterém se současně kopíruje několik sekvencí DNA do jednoho vzorku. Tato metoda vám umožňuje snížit spotřebu a snížit náklady na analýzu.
• Metoda PCR využívající technologii NASBA (Amplifikace založená na sekvenci nukleových kyselin) je, že RNA viru je použita jako templát pro kopírování genetického materiálu. Pomocí speciálních enzymů (transkriptáza, RNA polymeráza, RNáza) se v reakčním médiu vytvoří komplementární DNA (cDNA) a také komplex molekul RNA a cDNA. Rozdíl mezi touto modifikací a standardní PCR spočívá v tom, že ne DNA, ale RNA se hromadí jako genetický materiál. Rozdíl mezi touto metodou a metodou RT-PCR spočívá v tom, že RNA není pouze templátem pro syntézu cDNA, ale také amplifikačním produktem (tj. Konečným produktem reakce).

Molekuly DNA jsou v těle zničeny po velmi dlouhou dobu a mohou být u pacienta detekovány, i když antivirová nebo antibiotická terapie již fungovala. Standardní metoda PCR proto neumožňuje vyhodnotit účinnost terapie.

Na rozdíl od DNA lze molekuly RNA izolovat výhradně ze živých buněk nebo virů a po zničení živých buněk je molekula RNA také rychle zničena. Tato modifikace vám umožňuje kontrolovat účinek terapie již v době její implementace.

Výhody a nevýhody PCR

Ve srovnání s jinými laboratorními metodami pro detekci infekcí má metoda PCR několik výhod:

• Metoda PCR je přímá metoda stanovení genetického materiálu viru nebo bakterie ve vzorku. Na rozdíl od jiných metod, které určují nepřímé příznaky infekce, test PCR přímo indikuje přítomnost viru v těle.
• Vysoká specifičnost metody, to znamená, že schopnost identifikovat konkrétní patogen je spojena se skutečností, že je určen genetický materiál, který je pro daný organismus jedinečný (virus, bakterie, mikroskopická houba). Specifičnost této metody se proto blíží 100%.
• Vysoká citlivost metody (také téměř 100%) je množství vzorku, které lze touto metodou určit. Je stanoveno i malé množství virových nebo bakteriálních molekul v biologickém materiálu. To umožňuje identifikovat nositele viru ještě před nástupem symptomů.
• Tato metoda je univerzální pro detekci DNA / RNA jakýchkoli virů nebo bakterie. Pomocí PCR je možné určit jakékoli infekce, ale i chronická onemocnění.
• Metoda rychlé analýzy, doba trvání je přibližně 4-6 hodin.

Chyby:

• Polymerázová řetězová reakce je metodou přímé detekce genetického materiálu (DNA) patogenu, což neumožňuje vyhodnotit účinnost terapie, protože molekula DNA není po dlouhou dobu zničena, i když terapie již je pracoval.
• Vysoká citlivost metody může být její nevýhodou. Například po ukončení terapie PCR stále detekuje DNA mrtvých buněk u zdravého pacienta, čímž se získá falešně pozitivní výsledek.
• Různí výrobci testů PCR mohou detekovat stejné infekce pomocí různých systémů. Výsledky stanovení stejné infekce v laboratořích se proto mohou lišit. Ve stejné laboratoři se doporučuje provádět dynamické kvantitativní testy.
• Některé testy, zejména genetické, mohou být docela drahé.
• K provádění testů PCR je zapotřebí drahé vybavení, činidla a dobře vyškolený kvalifikovaný personál. Přesnost výsledků analýzy závisí na kvalitě činidel a způsobu odběru biologických vzorků.

K identifikaci infekcí je vhodná PCR (rozsah použití metody v medicíně)

Používá se metoda PCR pro identifikaci, tj. kvalitativní stanovení, jakož i pro kvantitativní stanovení DNA a RNA patogenů různých infekcí:

• virus lidské imunodeficience (HIV);
• viry hepatitidy A, B, C, D, G;
• patogeny, které způsobují onemocnění urogenitálního traktu, například Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• patogeny, které způsobují dysbiózu urogenitálního traktu a kandidózu, například mikroorganismy jako Saccharimonas aalborgensis, mikroskopické houby rodu Candida;
• původci infekcí lidským papilomavirem;
• TORCH a Herpesvirus infekce;
• patogeny přirozených fokálních infekcí, které mohou šířit ptáci, zvířata, hmyz sající krev, například borelióza, encefalitida, západonilská horečka;
• gastrointestinální infekce;
• původci tuberkulózy;
• respirační infekce (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• nozokomiální infekce (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

Virová nálož je také určena metodou PCR, zkoumá se dynamika onemocnění a účinek terapie.

Polymerázová řetězová reakce v medicíně má ještě jednu důležitou aplikaci - je to stanovení polymorfismů lidských genů (lokální změny) a mutací. Drobné lokální změny v sekvenci DNA různých genů jsou příčinou vzniku různých chorob.

Tato onemocnění mohou být dědičná. Metoda PCR umožňuje identifikovat tyto mutace a zabránit rozvoji nebo zmírnit průběh nemocí.

PCR se používá k detekci mutací, které způsobují vývoj nemocí, jako jsou:

• porušení srážení krve;
• kardiovaskulární choroby;
• metabolické poruchy (například intolerance laktózy);
• zhoršená reprodukční funkce (mutace, které způsobují mužskou neplodnost);
• rakovina prsu a vaječníků;
• autoimunitní onemocnění.

Ukázky pro výzkum

V závislosti na typu detekované infekce mohou být vzorky pro analýzu vzorky biologických tekutin, tkání, epiteliálních buněk:

• krevní sérum / plazma, periferní, pupečníková krev;
• vzorky epitelu sliznice (cervikální kanál, pochva, močová trubice);
• škrábání spojivky, nosní dutiny, orofaryngu;
• sperma, sekrece prostaty;
• škrábání z erozivních a ulcerativních lézí;
• moč;
• sputa;
• výkaly;
• jiné biologické tekutiny (plodová voda, mozkomíšní mok, plodová voda, kloubní tekutina);
• bioptický materiál plic, jater, gastrointestinálního traktu;
• bronchoalveolární laváž.

Pravidla pro dodávku biologických tekutin pro PCR

Polymerázová řetězová reakce je metoda, která vyžaduje přísné dodržování doporučení i ve fázi sběru biologického materiálu.

Nedostatečný odběr vzorků může vést k falešně pozitivním nebo falešně negativním výsledkům.

• Pokud je pro přepravu a skladování biologického materiálu před analýzou vyžadováno speciální transportní médium, doporučuje se použít transportní řešení vyrobené stejnou společností, která dodává soupravy PCR test.
• Odběr vzorků pro test PCR se provádí odděleně od vzorků určených pro jiné studie. K výběru se používají jednorázové sterilní nástroje, nádoby a rukavice.
• Doporučuje se odebrat vzorky k analýze před zahájením terapie a 2 týdny po jejím ukončení.
• Doporučuje se darovat krev ráno na prázdný žaludek. Celá krev je uložena v antikoagulačních zkumavkách (EDTA, sodná sůl kyseliny citrónové). Jiná antikoagulancia, jako je heparin, nejsou povolena, protože inhibují reakci PCR. Sérum je skladováno bez antikoagulancia.
• Při odběru moči je nutné sbírat ranní moč (první porce), asi 30-40 ml. Je povoleno uchovávat vzorek, dokud není odeslán do laboratoře po dobu nejvýše 2 hodin.
• Před sběrem slin vypláchněte ústa fyziologickým roztokem. Doporučuje se nejíst 4 hodiny před odebráním vzorku. Množství vzorku je od 3 do 5 ml. Sliny se shromažďují bezprostředně před analýzou; materiál lze skladovat zmrazený při minus 20 ° C.
• K odběru vzorků sputa se používají jednorázové zkumavky. Požadovaný objem vzorku je od 5 do 10 ml. Před analýzou lze vzorek skladovat 24 hodin při 4 ° C.
• Synoviální tekutina se odebírá injekční stříkačkou. Pro sběr a skladování materiálu se doporučuje používat jednorázové sterilní vybavení. Požadovaný objem vzorku je 1 ml.
• Chcete -li odebrat vzorek epitelu sliznic, použijte sondy (například z viskózy) nebo cytobrushes.

Jak se připravit na analýzu PCR

Správný sběr materiálu je nezbytný pro získání správných výsledků testů, proto se doporučuje dodržovat následující pravidla:

• Během akutního průběhu infekce se doporučuje sbírat biologický materiál, ale v tuto chvíli by neměla být přijímána antibakteriální činidla.
• Před odebráním vzorků z pochvy se doporučuje přestat užívat jakékoli vaginální léky a také neprovádět postupy, jako je sprchování po dobu 24 hodin.
• Před odebráním vzorku z močové trubice byste se měli zdržet močení po dobu 1,5-2 hodin, ošetřit vnější vstup močové trubice fyziologickým roztokem.
• Doporučuje se odebrat vzorky moči ráno na prázdný žaludek.
• Před sběrem slin je 12 hodin před odběrem vzorků přerušeno jídlo, léky a alkohol. Před odebráním vzorku se ústní dutina a zuby vyčistí zubním kartáčkem bez pasty, ústní dutina se musí důkladně vypláchnout vodou, bez použití dalších prostředků. Sliny se odebírají injekční stříkačkou.
• Při odebírání škrábanců z orofaryngu nejezte ani nepijte vodu po dobu 2 hodin. Nedoporučuje se používat spreje do krku, žvýkačky, pastilky nebo si čistit zuby.
• Při shromažďování sputa se doporučuje důkladně zpracovat ústní dutinu: vyčistit zuby, vypláchnout ústa. Sbírejte ranní sliznici nebo hnisavý výtok. K testování postačí 3 ml vzorek. Chcete -li zvýšit objem sekrecí, můžete si vzít expektorantní inhalace nebo léky.
• Na vnitřní stranu dolního víčka se odebere nátěr ze spojivky oka, aniž by se dotkl řas.

Výtěrový postup (pro ženy a muže)

Při zkoumání urogenitálního traktu u žen se provádí škrábání vaginální sliznice, močové trubice a cervikálního kanálu. Vzorky se odebírají před ruční kontrolou. Odběr vzorků se provádí pomocí sterilních sond pomocí tampónu nebo cytobrush.

Před zákrokem je vnější oblast močové trubice ošetřena sterilním roztokem, přebytečný hlen je odstraněn z pochvy a děložního čípku. Sonda se zavádí do močové trubice nebo do děložního hrdla do hloubky 0,5-1,5 cm. Materiál se sbírá jemnými rotačními pohyby.

Ze zadní části pochvy se odebere tampon. Při vyjímání sondy se nedoporučuje dotýkat se jí stěn pochvy.

Sonda (její pracovní oblast) se promyje ve zkumavce transportní kapalinou, kterou dodává výrobce soupravy pro diagnostiku PCR, a přitiskne se ke stěnám zkumavky. Někdy výrobce sady doporučuje přerušit sondu a nechat pracovní část přímo v trubici. Tím se sníží ztráta vzorku.

Po kolposkopii se nedoporučuje odebírat nátěr na PCR. Před přijetím materiálu se doporučuje přestat užívat vaginální tablety a léky za 2-3 dny. Nátěr se odebírá nejdříve 2-3 dny po skončení menstruačního toku.

Při odběru nátěru od mužů se vnější oblast močové trubice ošetří sterilním roztokem a odstraní se přebytečné sekrety. K odběru vzorku se vloží sterilní sonda o průměru 3 až 4 cm. Pracovní část sondy se promyje ve zkumavce transportním roztokem.

Jak se dešifrují testy PCR

Ve výsledcích testu PCR je kromě názvu analýzy a výsledků testu uvedeno normou nebo referenčními hodnotami, se kterými lze získaný výsledek porovnat:

Název analýzy	Výsledek	Norma
DNA Chlamidia trachomatis	Pozitivní	Negativní
Micoplasma hominis DNA	Negativní	Negativní

Pozitivní výsledek znamená přítomnost DNA patogenu v biologickém materiálu, negativní výsledek znamená jeho nepřítomnost.

Při hodnocení virové zátěže se kvantifikuje DNA. V tomto případě tabulka výsledků obsahuje číselnou hodnotu počtu kopií detekované DNA, například:

Index	Výsledek	Referenční hodnoty
Kvantifikace DNA viru hepatitidy B	4,3 * 10v 3 st.	<300 klinicky nevýznamných; > 300 pozitivních

V případě kvalitativní a kvantitativní analýzy hodnotí výsledky ošetřující lékař.

Při analýze získaných výsledků se často vyskytují následující chyby:

• Včasný kontrolní test PCR po ukončení léčby antibiotiky (po 1-2 týdnech). DNA infekčního agens zůstává v těle pacienta několik týdnů poté, co jsou buňky infekčního agens zničeny terapií. Proto je získaný pozitivní výsledek falešně pozitivní a závěr, že terapie nefungovala, je mylný. Pokud mluvíme o původcích infekce na epitelu kůže, pak se test doporučuje provést nejdříve měsíc po ukončení léčby.
• Při interpretaci PCR analýzy některých infekcí, například cytomegalovirová infekce, pozitivní výsledek neznamená vždy průběh infekčního procesu a potřebu terapie. Pouze v 60% případů s pozitivním výsledkem PCR se u pacientů rozvinou klinické příznaky onemocnění.
• Při interpretaci testů PCR na lidský papilomavirus pozitivní test lze mylně interpretovat jako příčinu rozvoje onkologických procesů, přestože u 90% pacientů infekce HPV odezní za 6-24 měsíců. Pokud je výsledek pozitivní, je nutné provést studii epitelu děložního čípku a teprve poté posoudit riziko rakoviny.
• Při studiích infekcí urogenitálního traktu u žen se doporučuje nejen stanovit oportunní infekce, ale také porovnat jejich počet s počtem Lactovacillus, které jsou považovány za hlavní představitele normální mikroflóry pochvy. Taková analýza vám umožňuje určit dysbiózu, správně interpretovat výsledky testu PCR a předepsat terapii.

Polymerázová řetězová reakce je metoda, která se používá ke kvantitativnímu studiu virové a bakteriální zátěže. Je třeba mít na paměti, že u některých infekcí neexistuje jasná regulace, která vám umožňuje určit klinický význam získaných výsledků.

To znamená, že interpretace výsledků je subjektivní a může být chybná. Tedy například oportunistické Ureaplasma, Micoplasma, Gardnerella při absenci stížností a klinických příznaků zánětu nevyžadují terapii. Bezdůvodné předepisování terapie vede ke zvýšení případů dysbiózy a vaginózy.

Video o analýze PCR

Diagnostika virové infekce pomocí PCR: vysvětlení metody: