Réaction en chaîne par polymérase (PCR). Qu'est-ce que c'est, une méthode en microbiologie, médecine, culture, frottis

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode de laboratoire moderne pour générer un grand nombre de copies de sections individuelles d'acides nucléiques (ADN ou ARN). La PCR est utilisée dans de nombreux domaines de la biologie et de la médecine. Dans le diagnostic médical, cette méthode est utilisée pour déterminer maladies infectieuses.

En biologie moléculaire, le but de la copie peut être un morceau d'ADN pour étudier la fonction d'un gène particulier ou d'autres expériences (clonage de gènes, introduction d'autres gènes, identification de mutations). Dans un examen médico-légal, l'ADN est examiné pour correspondre au matériel génétique des suspects sur les lieux du crime.

Qu'est-ce que l'analyse ?

Dans le diagnostic des maladies à l'aide de la méthode PCR, une section spécifique de l'ADN de l'agent infectieux est isolée dans le matériel biologique du patient. Si ce site est trouvé, c'est une preuve directe de la présence de l'agent pathogène dans le corps du patient.

La PCR peut également détecter des changements dans le matériel génétique du patient., qui aident à déterminer les maladies congénitales, les modifications du système immunitaire, la prédisposition à diverses maladies.

Lors de l'analyse par PCR, une certaine partie de la molécule d'ADN ou d'ARN de l'agent causal de la maladie contenue dans le matériel biologique est isolée de l'échantillon par des méthodes spéciales. Ensuite, ce site est dupliqué plusieurs fois à l'aide d'enzymes.

La quantité d'ADN est synthétisée et peut être enregistrée visuellement. Seule une certaine partie de la molécule d'ADN est copiée.

La PCR nécessite les composants suivants :

• Modèle d'ADN (un morceau d'ADN qui est copié et identifié à plusieurs reprises),
• amorces (molécules d'ADN court simple brin spécialement synthétisées nécessaires pour amorcer la synthèse d'ADN),
• l'ADN polymérase (une enzyme qui catalyse la réaction de polymérisation de l'ADN), les désoxynucléosides triphosphates (les bases azotées sont les molécules qui composent l'ADN).
• Autres composants (ions magnésium, solution tampon).

La réaction en chaîne par polymérase est une méthode qui nécessite un équipement spécial (amplificateur), elle comprend les étapes suivantes :

• Dénaturation de l'ADN matrice, dans laquelle l'ADN double brin est clivé en deux brins. Cette étape dure 30-40 secondes.
• L'attachement des amorces à des régions spécifiques de l'ADN se produit en 20 à 60 secondes.
• La polymérisation est la synthèse de nouveaux brins d'ADN à l'aide d'une enzyme.

Après répétition répétée de ces étapes, le nombre de copies requis est synthétisé (après 20 cycles, le nombre de copies atteint plus d'un million).

L'enregistrement de l'ADN du virus est effectué après amplification dans un dispositif spécial (si PCR avec détection dans point final) ou directement dans l'amplificateur pendant la réaction (si PCR en temps réel est utilisé) fluorescent méthode.

Où puis-je m'enregistrer, combien ça coûte

L'analyse PCR peut être effectuée dans n'importe quel laboratoire médical accrédité pour cette analyse.

Le coût du test dépend du type d'infection :

Laboratoire	Infection / coût
KDL	ADN du cytomégalovirus - 230 roubles ADN de l'herpèsvirus de type 6 - 250 roubles. ARN coronavirus SARS-CoV-2/1600 roubles.
Hémotest	ADN du cytomégalovirus - 250 roubles ADN de l'herpèsvirus de type 6 - 240 roubles. ARN coronavirus SARS-CoV-2 - 1700 roubles.
In vitro	ADN du cytomégalovirus dans le sang - 400 roubles. ADN des types d'herpèsvirus humains 1 et 2 dans le grattage des cellules épithéliales de la peau - 570 roubles. ARN coronavirus SARS-CoV-2 - 1990 roubles.
Citylab	ADN du cytomégalovirus - 240 roubles ADN du virus de l'herpès humain de type 6 - 290 roubles. ARN coronavirus SARS-CoV-2 - 1800 roubles.

Variétés de PCR

L'amplification en chaîne par polymérase est une méthode pour laquelle différentes méthodes de mise en place de l'analyse ont été développées.

Ces méthodes ont été conçues pour réduire le risque de résultats faussement positifs et faussement négatifs, ou pour effectuer des analyses quantitatives. ou qualitative, ainsi que pour le dosage de différents acides nucléiques: ADN (acide désoxyribonucléique) ou ARN (acide ribonucléique).

Selon la méthode de détermination des produits de réaction, on distingue deux types de PCR :

• Pcr en temps réel - l'amplification et la détection sont réalisées simultanément dans un même appareil. Avec cette modification de la PCR, il est possible de déterminer la quantité de séquence d'ADN souhaitée à chaque cycle de synthèse d'ADN.
• PCR en point final - une sorte d'analyse PCR, dans laquelle les résultats sont enregistrés par la méthode de fluorescence dans un appareil spécial, après la fin de la réaction en chaîne par polymérase.

Dans la pratique du laboratoire, il existe différentes manières de mettre en place l'analyse, telles que :

• PCR de démarrage à chaud. La particularité de cette méthode est que la réaction ne démarre que lorsqu'une certaine température est atteinte. Les composants de la réaction (en particulier les enzymes) sont bloqués et ne commencent à fonctionner qu'à une certaine température. Cette méthode améliore la précision de l'analyse. Si le mélange réactionnel est chauffé progressivement, il existe un risque de formation de sous-produits de réaction et, par conséquent, des résultats d'analyse inexacts.
• Pour la détection de virus avec un génome à ARNpar exemple, pour le type de l'hépatite C ou le virus de l'immunodéficience humaine, une méthode appelée PCR à transcription inverse (RT-PCR) est utilisée. L'ARN du virus est d'abord converti en une molécule d'ADN complémentaire. L'ADN résultant est ensuite utilisé comme matrice pour la PCR.
• PCR multi-amorces - une méthode de réalisation de la réaction, dans laquelle plusieurs séquences d'ADN sont simultanément copiées dans un même échantillon. Cette méthode permet de réduire les consommables et de réduire le coût d'analyse.
• Méthode PCR utilisant la technologie NASBA (amplification basée sur la séquence d'acides nucléiques) est que l'ARN du virus est utilisé comme matrice pour copier le matériel génétique. À l'aide d'enzymes spéciales (transcriptase, ARN polymérase, RNase), un ADN complémentaire (ADNc) est formé dans le milieu réactionnel, ainsi qu'un complexe de molécules d'ARN et d'ADNc. La différence entre cette modification et la PCR standard est que ce n'est pas l'ADN, mais l'ARN qui est accumulé en tant que matériel génétique. La différence entre cette méthode et la méthode RT-PCR est que l'ARN n'est pas seulement une matrice pour la synthèse d'ADNc, mais également un produit d'amplification (c'est-à-dire le produit final de la réaction).

Les molécules d'ADN sont détruites dans l'organisme pendant très longtemps et peuvent être détectées chez un patient même si un traitement antiviral ou antibiotique a déjà fonctionné. Par conséquent, la méthode PCR standard ne permet pas d'évaluer l'efficacité de la thérapie.

Contrairement à l'ADN, les molécules d'ARN peuvent être isolées exclusivement à partir de cellules vivantes ou de virus, et après la destruction des cellules vivantes, la molécule d'ARN est également rapidement détruite. Cette modification vous permet de contrôler l'effet de la thérapie déjà au moment de sa mise en œuvre.

Avantages et inconvénients de la PCR

Par rapport aux autres méthodes de laboratoire de détection des infections, la méthode PCR présente plusieurs avantages :

• La méthode PCR est une méthode directe détermination du matériel génétique d'un virus ou d'une bactérie dans un échantillon. Contrairement à d'autres méthodes qui déterminent les signes indirects d'infection, le test PCR indique directement la présence d'un virus dans le corps.
• Haute spécificité de la méthode, c'est-à-dire que la capacité d'identifier un agent pathogène spécifique est associée au fait que le matériel génétique est déterminé qui est unique à un organisme donné (virus, bactérie, champignon microscopique). Par conséquent, la spécificité de cette méthode est proche de 100 %.
• Haute sensibilité de la méthode (également proche de 100 %) est la quantité d'échantillon qui peut être déterminée par cette méthode. Même une petite quantité de virus ou de molécules bactériennes dans le matériel biologique est déterminée. Cela permet d'identifier le porteur du virus avant même l'apparition des symptômes.
• La méthode est universelle pour détecter l'ADN/ARN de tout virus ou des bactéries. Avec l'aide de la PCR, il est possible de déterminer les infections, ainsi que les maladies chroniques.
• Méthode d'analyse rapide, la durée est d'environ 4-6 heures.

Défauts:

• La réaction en chaîne par polymérase est une méthode de détection directe du matériel génétique (ADN) de l'agent pathogène, et elle ne permet pas évaluer l'efficacité de la thérapie, puisque la molécule d'ADN n'est pas détruite pendant longtemps, même si la thérapie est déjà travaillé.
• La grande sensibilité de la méthode peut être son inconvénient. Par exemple, une fois le traitement terminé, la PCR détecte toujours l'ADN des cellules mortes chez un patient sain, obtenant ainsi un résultat faussement positif.
• Différents fabricants de tests PCR peuvent détecter les mêmes infections en utilisant différents systèmes. Par conséquent, les résultats de la détermination de la même infection en laboratoire peuvent différer. Il est recommandé d'effectuer des tests quantitatifs dynamiques dans le même laboratoire.
• Certains tests, en particulier les tests génétiques, peuvent être assez coûteux.
• Pour effectuer des tests PCR, un équipement coûteux, des réactifs et un personnel qualifié bien formé sont nécessaires. La précision des résultats d'analyse dépend de la qualité des réactifs et de la méthode de prélèvement des échantillons biologiques.

Pour identifier quelles infections la PCR est appropriée (champ d'application de la méthode en médecine)

La méthode PCR est utilisée pour l'identification, c'est-à-dire la détermination qualitative, ainsi que pour la détermination quantitative de l'ADN et de l'ARN des agents pathogènes de diverses infections :

• virus de l'immunodéficience humaine (VIH);
• virus de l'hépatite A, B, C, D, G;
• les agents pathogènes qui causent des maladies du tractus urogénital, par exemple, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• des agents pathogènes qui provoquent une dysbiose du tractus urogénital et une candidose, par exemple des micro-organismes tels que Saccharimonas aalborgensis, des champignons microscopiques du genre Candida;
• agents responsables d'infections à papillomavirus humain;
• Infections TORCH et Herpesvirus;
• agents pathogènes d'infections focales naturelles qui peuvent être propagées par les oiseaux, les animaux, les insectes hématophages, par exemple la borréliose, l'encéphalite, la fièvre du Nil occidental ;
• infections gastro-intestinales;
• agents responsables de la tuberculose;
• infections respiratoires (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• infections nosocomiales (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

En outre, la charge virale est déterminée par la méthode PCR, la dynamique de la maladie et l'effet de la thérapie sont étudiés.

La réaction en chaîne de la polymérase en médecine a une autre application importante - c'est la détermination des polymorphismes des gènes humains (changements locaux) et des mutations. Des changements locaux mineurs dans la séquence d'ADN de différents gènes sont à l'origine du développement de diverses maladies.

Ces maladies peuvent être héréditaires. La méthode PCR permet d'identifier ces mutations et de prévenir le développement ou d'atténuer l'évolution de maladies.

La PCR est utilisée pour détecter les mutations qui provoquent le développement de maladies telles que :

• violation de la coagulation du sang;
• maladies cardiovasculaires;
• troubles métaboliques (par exemple, intolérance au lactose);
• fonction de reproduction altérée (mutations qui provoquent l'infertilité masculine);
• cancer du sein et de l'ovaire;
• maladies auto-immunes.

Échantillons pour la recherche

Selon le type d'infection détecté, les échantillons à analyser peuvent être des échantillons de fluides biologiques, de tissus, de cellules épithéliales :

• sérum sanguin / plasma, périphérique, sang de cordon ombilical;
• échantillons d'épithélium muqueux (canal cervical, vagin, urètre);
• raclures de la conjonctive, de la cavité nasale, de l'oropharynx;
• sperme, sécrétion de la prostate;
• grattage des lésions érosives et ulcéreuses;
• urine;
• expectorations;
• excréments;
• autres liquides biologiques (liquide amniotique, liquide céphalo-rachidien, liquide amniotique, liquide articulaire);
• matériel de biopsie des poumons, du foie, du tractus gastro-intestinal;
• lavage broncho-alvéolaire.

Règles pour la livraison de fluides biologiques pour PCR

La réaction en chaîne par polymérase est une méthode qui nécessite le strict respect des recommandations, même au stade de la collecte du matériel biologique.

Un échantillonnage inadéquat peut conduire à des résultats faussement positifs ou faussement négatifs.

• Si un milieu de transport spécial est requis pour le transport et le stockage du matériel biologique avant l'analyse, il est recommandé d'utiliser une solution de transport fabriquée par la même société qui fournit les kits PCR test.
• L'échantillonnage pour le test PCR est effectué séparément des échantillons destinés à d'autres études. Pour la sélection, des instruments stériles jetables, des conteneurs et des gants sont utilisés.
• Il est recommandé de prélever des échantillons pour analyse avant le début du traitement et 2 semaines après sa fin.
• Il est recommandé de donner du sang le matin à jeun. Le sang total est stocké dans des tubes anticoagulants (EDTA, acide citrique sodique). Les autres anticoagulants, comme l'héparine, ne sont pas autorisés car ils inhibent la réaction PCR. Le sérum est conservé sans anticoagulant.
• Lors de la collecte d'urine, il est nécessaire de collecter l'urine du matin (première portion), environ 30 à 40 ml. Il est permis de conserver l'échantillon jusqu'à ce qu'il soit envoyé au laboratoire pendant pas plus de 2 heures.
• Avant de recueillir la salive, rincez la bouche avec une solution saline. Il est recommandé de ne pas manger pendant 4 heures avant de prélever l'échantillon. La quantité d'échantillon est de 3 à 5 ml. La salive est recueillie juste avant l'analyse; le matériel peut être conservé congelé à moins 20 °C.
• Des tubes jetables sont utilisés pour prélever des échantillons d'expectorations. Le volume d'échantillon requis est de 5 à 10 ml. Avant analyse, l'échantillon peut être conservé à 4°C pendant 24 heures.
• Le liquide synovial est prélevé avec une seringue. Il est recommandé d'utiliser un équipement stérile jetable pour la collecte et le stockage du matériel. Le volume d'échantillon requis est de 1 ml.
• Pour prélever un échantillon de l'épithélium des muqueuses, des sondes (par exemple en viscose) ou des cytobrosses sont utilisées.

Comment se préparer à l'analyse PCR

Une collecte correcte du matériel est nécessaire pour obtenir des résultats de test corrects, il est donc recommandé d'observer les règles suivantes :

• Il est recommandé de prélever du matériel biologique au cours d'une infection aiguë, mais les agents antibactériens ne doivent pas être pris à ce moment-là.
• Avant de prélever des échantillons dans le vagin, il est recommandé d'arrêter de prendre des médicaments vaginaux et de ne pas effectuer de procédures telles que les douches vaginales pendant 24 heures.
• Avant de prélever un échantillon de l'urètre, vous devez vous abstenir d'uriner pendant 1,5 à 2 heures, traiter l'entrée externe de l'urètre avec une solution saline.
• Il est recommandé de prélever les échantillons d'urine à jeun le matin.
• Avant de recueillir la salive, la nourriture, les médicaments et l'alcool sont interrompus 12 heures avant le prélèvement de l'échantillon. Avant de prélever l'échantillon, la cavité buccale et les dents sont nettoyées avec une brosse à dents sans pâte, la cavité buccale doit être soigneusement rincée à l'eau, sans utiliser d'agents supplémentaires. La salive est recueillie avec une seringue.
• Lorsque vous prélevez des raclures de l'oropharynx, ne pas manger ni boire d'eau pendant 2 heures. Il n'est pas recommandé d'utiliser des sprays pour la gorge, des chewing-gums, des pastilles ou de se brosser les dents.
• Lors de la collecte des expectorations, il est recommandé de traiter soigneusement la cavité buccale: brossez-vous les dents, rincez-vous la bouche. Recueillir les sécrétions muqueuses ou purulentes du matin. Un échantillon de 3 ml est suffisant pour le test. Pour augmenter le volume des sécrétions, vous pouvez prendre des inhalations d'expectorants ou des médicaments.
• Un frottis de la conjonctive de l'œil est prélevé sur la face interne de la paupière inférieure, sans toucher les cils.

Procédure de prélèvement de frottis (pour les femmes et les hommes)

Lors de l'examen du tractus urogénital chez la femme, un grattage de la muqueuse vaginale, de l'urètre et du canal cervical est effectué. Des échantillons sont prélevés avant l'inspection manuelle. Le prélèvement est effectué à l'aide de sondes stériles avec un écouvillon ou une cytobrosse.

Avant la procédure, la zone externe de l'urètre est traitée avec une solution stérile, l'excès de mucus est éliminé du vagin et du col de l'utérus. La sonde est insérée dans l'urètre ou dans le canal cervical à une profondeur de 0,5 à 1,5 cm. Le matériau est collecté avec des mouvements de rotation doux.

Un écouvillon est prélevé à l'arrière du vagin. Lors du retrait de la sonde, il n'est pas recommandé de toucher les parois du vagin avec.

La sonde (sa zone de travail) est lavée dans un tube à essai avec un liquide de transport, fourni par le fabricant d'un kit de diagnostic PCR, et pressée contre les parois du tube à essai. Parfois, le fabricant du kit recommande de casser la sonde et de laisser la partie active directement dans le tube. Cela réduit la perte d'échantillon.

Il n'est pas recommandé de faire des frottis pour PCR après colposcopie. Avant de prendre le matériel, il est recommandé d'arrêter de prendre des comprimés vaginaux et des médicaments dans 2-3 jours. Le frottis est pris au plus tôt 2-3 jours après la fin du flux menstruel.

Lors du prélèvement d'un frottis chez l'homme, la région externe de l'urètre est traitée avec une solution stérile et les sécrétions en excès sont éliminées. Une sonde stérile est insérée à 3-4 cm pour prélever un échantillon. La partie active de la sonde est lavée dans un tube à essai avec une solution de transport.

Comment les tests PCR sont-ils déchiffrés

Dans les résultats du test PCR, en plus du nom de l'analyse et des résultats du test, il est indiqué valeurs normatives ou de référence avec lesquelles le résultat obtenu peut être comparé:

Nom de l'analyse	Résultat	Norme
ADN de Chlamidia trachomatis	Positif	Négatif
ADN de Micoplasma hominis	Négatif	Négatif

Un résultat positif signifie la présence d'un ADN pathogène dans le matériel biologique, un résultat négatif signifie son absence.

Lors de l'évaluation de la charge virale, l'ADN est quantifié. Dans ce cas, le tableau des résultats contient la valeur numérique du nombre de copies de l'ADN détecté, par exemple :

Indice	Résultat	Valeurs de référence
Quantification de l'ADN du virus de l'hépatite B	4.3 * 10v 3 st.	<300 cliniquement non significatif; > 300 positifs

En cas d'analyse qualitative et quantitative, les résultats sont évalués par le médecin traitant.

Lors de l'analyse des résultats obtenus, les erreurs suivantes sont souvent rencontrées :

• Test PCR de contrôle précoce après la fin du traitement antibiotique (après 1-2 semaines). L'ADN de l'agent infectieux reste dans le corps du patient pendant plusieurs semaines après la destruction des cellules de l'agent infectieux par la thérapie. Par conséquent, le résultat positif obtenu est un faux positif et la conclusion selon laquelle la thérapie n'a pas fonctionné est erronée. Si nous parlons d'agents responsables de l'infection de l'épithélium cutané, il est recommandé d'effectuer le test au plus tôt un mois après la fin du traitement.
• Lors de l'interprétation de l'analyse PCR de certaines infections, par exemple, une infection à cytomégalovirus, un résultat positif ne signifie pas toujours l'évolution du processus infectieux et la nécessité d'un traitement. Dans seulement 60% des cas avec un résultat PCR positif, les patients développent des signes cliniques de la maladie.
• Lors de l'interprétation des tests PCR pour le virus du papillome humain un test positif peut être interprété à tort comme la cause du développement de processus oncologiques, bien que chez 90 % des patients, l'infection au VPH se résolve en 6 à 24 mois. Si le résultat est positif, il est nécessaire de procéder à une étude de l'épithélium du col de l'utérus et d'évaluer ensuite le risque de cancer.
• Dans les études sur les infections du tractus urogénital chez la femme, il est recommandé non seulement de déterminer les infections opportunistes, mais aussi de comparer leur nombre avec le nombre de Lactovacillus, qui sont considérés comme les principaux représentants de la microflore normale du vagin. Une telle analyse vous permet de déterminer la dysbiose, d'interpréter correctement les résultats du test PCR et de prescrire un traitement.

La réaction en chaîne par polymérase est une méthode utilisée pour quantifier la charge virale et bactérienne. Il convient de garder à l'esprit que pour certaines infections, il n'existe pas de réglementation claire permettant de déterminer la signification clinique des résultats obtenus.

Cela signifie que l'interprétation des résultats est subjective et peut être erronée. Ainsi, par exemple, opportuniste Ureaplasma, Micoplasme, Gardnerella en l'absence de plaintes et de signes cliniques d'inflammation, ils ne nécessitent pas de traitement. La prescription déraisonnable du traitement entraîne une augmentation des cas de dysbiose et de vaginose.

Vidéo sur l'analyse PCR

Diagnostic PCR de l'infection virale: explication de la méthode :