Reaksi berantai polimerase (PCR). Apa itu, metode dalam mikrobiologi, kedokteran, budaya, smear

Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah metode laboratorium modern untuk menghasilkan sejumlah besar salinan bagian individu asam nukleat (DNA atau RNA). PCR digunakan di banyak bidang biologi dan kedokteran. Dalam diagnosa medis, metode ini digunakan untuk menentukan penyakit menular.

Dalam biologi molekuler, tujuan penyalinan dapat berupa potongan DNA untuk mempelajari fungsi gen tertentu atau eksperimen lain (kloning gen, pengenalan gen lain, identifikasi mutasi). Dalam pemeriksaan forensik, DNA diperiksa untuk mencocokkan materi genetik tersangka di TKP.

Apa itu analisis?

Dalam diagnosis penyakit

menggunakan metode PCR, bagian spesifik dari DNA agen infeksi diisolasi dalam bahan biologis pasien. Jika situs ini ditemukan, ini adalah bukti langsung adanya patogen dalam tubuh pasien.

PCR juga dapat mendeteksi perubahan materi genetik pasien., yang membantu menentukan penyakit bawaan, perubahan sistem kekebalan tubuh, kecenderungan berbagai penyakit.

Saat melakukan analisis PCR, bagian tertentu dari molekul DNA atau RNA dari agen penyebab penyakit yang terkandung dalam bahan biologis diisolasi dari sampel dengan metode khusus. Kemudian situs ini digandakan berkali-kali dengan bantuan enzim.

Jumlah DNA yang disintesis dapat direkam secara visual. Hanya bagian tertentu dari molekul DNA yang disalin.

PCR membutuhkan komponen berikut:

• Template DNA (sepotong DNA yang berulang kali disalin dan diidentifikasi),
• primer (molekul DNA pendek untai tunggal yang disintesis secara khusus yang diperlukan untuk menyemai sintesis DNA),
• DNA polimerase (enzim yang mengkatalisis reaksi polimerisasi DNA), deoxynucleoside triphosphates (basa nitrogen adalah molekul yang membentuk DNA).
• Komponen lain (ion magnesium, larutan buffer).

Reaksi berantai polimerase merupakan metode yang memerlukan peralatan khusus (penguat), terdiri dari langkah-langkah sebagai berikut:

• Denaturasi DNA template, di mana DNA untai ganda dibelah menjadi dua untai. Tahap ini berlangsung selama 30-40 detik.
• Perlekatan primer ke daerah spesifik DNA terjadi dalam waktu 20-60 detik.
• Polimerisasi adalah sintesis untai DNA baru menggunakan enzim.

Setelah pengulangan berulang dari tahap-tahap ini, jumlah salinan yang diperlukan disintesis (setelah 20 siklus, jumlah salinan mencapai lebih dari satu juta).

Registrasi DNA virus dilakukan setelah amplifikasi dalam alat khusus (jika PCR dengan deteksi di titik akhir) atau langsung di amplifier selama reaksi (jika PCR waktu nyata digunakan) fluorescent metode.

Di mana saya bisa check-in, berapa biayanya?

Analisis PCR dapat dilakukan di laboratorium medis mana pun yang terakreditasi untuk analisis ini.

Biaya tes tergantung pada jenis infeksi:

Laboratorium	Infeksi / biaya
KDL	DNA sitomegalovirus - 230 rubel DNA virus herpes tipe 6 - 250 rubel. RNA coronavirus SARS-CoV-2/1600 rubel.
paling hemat	DNA sitomegalovirus - 250 rubel DNA virus herpes tipe 6 - 240 rubel. RNA coronavirus SARS-CoV-2 - 1700 rubel.
Invitro	DNA sitomegalovirus dalam darah - 400 rubel. DNA virus herpes manusia tipe 1 dan 2 dalam pengikisan sel epitel kulit - 570 rubel. RNA coronavirus SARS-CoV-2 - 1990 rubel.
Citylab	DNA sitomegalovirus - 240 rubel DNA virus herpes manusia tipe 6 - 290 rubel. RNA coronavirus SARS-CoV-2 - 1800 rubel.

Varietas PCR

Reaksi berantai polimerase adalah metode di mana metode yang berbeda untuk menyiapkan analisis telah dikembangkan.

Metode ini dirancang untuk mengurangi risiko hasil positif palsu dan negatif palsu, atau untuk melakukan kuantitatif atau analisis kualitatif, serta untuk penentuan asam nukleat yang berbeda: DNA (asam deoksiribonukleat) atau RNA (asam ribonukleat).

Menurut metode untuk menentukan produk reaksi, dua jenis PCR dibedakan:

• PCR waktu nyata - amplifikasi dan deteksi dilakukan secara bersamaan dalam satu perangkat. Dengan modifikasi PCR ini, dimungkinkan untuk menentukan jumlah sekuens DNA yang diinginkan pada setiap siklus sintesis DNA.
• PCR titik akhir - semacam analisis PCR, di mana hasilnya dicatat dengan metode fluoresensi dalam perangkat khusus, setelah akhir reaksi berantai polimerase.

Dalam praktik laboratorium, ada berbagai cara menyiapkan analisis, seperti:

• PCR mulai panas. Keunikan metode ini adalah bahwa reaksi dimulai hanya ketika suhu tertentu tercapai. Komponen reaksi (terutama enzim) diblokir dan mulai bekerja hanya pada suhu tertentu. Metode ini meningkatkan akurasi analisis. Jika campuran reaksi dipanaskan secara bertahap, ada risiko pembentukan produk samping reaksi dan, oleh karena itu, hasil analisis yang tidak akurat.
• Untuk mendeteksi virus dengan genom RNAmisalnya, tipe hepatitis C atau human immunodeficiency virus, metode yang disebut reverse transcription PCR (RT-PCR) digunakan. RNA virus pertama kali diubah menjadi molekul DNA komplementer. DNA yang dihasilkan kemudian digunakan sebagai template untuk PCR.
• PCR multi primer - metode pelaksanaan reaksi, di mana beberapa urutan DNA secara bersamaan disalin dalam satu sampel. Metode ini memungkinkan Anda untuk mengurangi bahan habis pakai dan mengurangi biaya analisis.
• Metode PCR menggunakan teknologi NASBA (Amplifikasi berdasarkan urutan asam nukleat) adalah bahwa RNA virus digunakan sebagai cetakan untuk menyalin materi genetik. Dengan bantuan enzim khusus (transkriptase, RNA polimerase, RNase), DNA komplementer (cDNA) terbentuk dalam media reaksi, serta kompleks molekul RNA dan cDNA. Perbedaan antara modifikasi ini dan PCR standar adalah bahwa bukan DNA, tetapi RNA yang terakumulasi sebagai materi genetik. Perbedaan antara metode ini dan metode RT-PCR adalah bahwa RNA tidak hanya template untuk sintesis cDNA, tetapi juga produk amplifikasi (yaitu, produk akhir dari reaksi).

Molekul DNA dihancurkan dalam tubuh untuk waktu yang sangat lama dan dapat dideteksi pada pasien bahkan jika terapi antivirus atau antibiotik telah berhasil. Oleh karena itu, metode PCR standar tidak memungkinkan evaluasi efektivitas terapi.

Tidak seperti DNA, molekul RNA dapat diisolasi secara eksklusif dari sel hidup atau virus, dan setelah penghancuran sel hidup, molekul RNA juga dihancurkan dengan cepat. Modifikasi ini memungkinkan Anda untuk mengontrol efek terapi pada saat implementasinya.

Kelebihan dan kekurangan PCR

Dibandingkan dengan metode laboratorium lain untuk mendeteksi infeksi, metode PCR memiliki beberapa keunggulan:

• Metode PCR adalah metode langsung penentuan materi genetik virus atau bakteri dalam sampel. Tidak seperti metode lain yang menentukan tanda-tanda infeksi tidak langsung, tes PCR secara langsung menunjukkan adanya virus di dalam tubuh.
• Spesifisitas metode yang tinggi, yaitu, kemampuan untuk mengidentifikasi patogen tertentu dikaitkan dengan fakta bahwa materi genetik ditentukan yang unik untuk organisme tertentu (virus, bakteri, jamur mikroskopis). Oleh karena itu, spesifisitas metode ini mendekati 100%.
• Sensitivitas tinggi dari metode ini (juga mendekati 100%) adalah jumlah sampel yang dapat ditentukan dengan metode ini. Bahkan sejumlah kecil virus atau molekul bakteri dalam bahan biologis ditentukan. Hal ini memungkinkan untuk mengidentifikasi pembawa virus bahkan sebelum timbulnya gejala.
• Metode ini universal untuk mendeteksi DNA / RNA dari virus apa pun atau bakteri. Dengan bantuan PCR, dimungkinkan untuk menentukan infeksi apa pun, serta penyakit kronis.
• Metode analisis cepat, durasinya sekitar 4-6 jam.

Kekurangan:

• Reaksi berantai polimerase adalah metode deteksi langsung materi genetik (DNA) patogen, dan itu tidak memungkinkan mengevaluasi efektivitas terapi, karena molekul DNA tidak dihancurkan untuk waktu yang lama, bahkan jika terapi sudah dilakukan bekerja.
• Sensitivitas tinggi dari metode ini mungkin menjadi kelemahannya. Misalnya, setelah selesai terapi, PCR masih mendeteksi DNA sel mati pada pasien yang sehat, sehingga diperoleh hasil positif palsu.
• Produsen tes PCR yang berbeda dapat mendeteksi infeksi yang sama menggunakan sistem yang berbeda. Oleh karena itu, hasil penentuan infeksi yang sama di laboratorium mungkin berbeda. Tes kuantitatif dinamis direkomendasikan untuk dilakukan di laboratorium yang sama.
• Beberapa tes, terutama tes genetik, bisa sangat mahal.
• Untuk melakukan tes PCR, diperlukan peralatan yang mahal, reagen, dan personel yang terlatih dengan baik. Keakuratan hasil analisis tergantung pada kualitas reagen dan metode pengambilan sampel biologis.

Untuk mengidentifikasi infeksi PCR yang cocok (lingkup penerapan metode dalam kedokteran)

Metode PCR digunakan untuk identifikasi, yaitu penentuan kualitatif, serta untuk penentuan kuantitatif DNA dan RNA patogen berbagai infeksi:

• virus imunodefisiensi manusia (HIV);
• virus hepatitis A, B, C, D, G;
• patogen yang menyebabkan penyakit pada saluran urogenital, misalnya Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• patogen yang menyebabkan dysbiosis pada saluran urogenital dan kandidiasis, misalnya, mikroorganisme seperti Saccharimonas aalborgensis, jamur mikroskopis dari genus Candida;
• agen penyebab infeksi human papillomavirus;
• Infeksi TORCH dan Herpesvirus;
• patogen infeksi fokal alami yang dapat disebarkan oleh burung, hewan, serangga penghisap darah, misalnya borreliosis, ensefalitis, demam West Nile;
• infeksi saluran pencernaan;
• agen penyebab tuberkulosis;
• infeksi saluran pernapasan (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• infeksi nosokomial (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

Juga, viral load ditentukan oleh metode PCR, dinamika penyakit dan efek terapi diselidiki.

Reaksi berantai polimerase dalam kedokteran memiliki aplikasi penting lainnya - ini adalah penentuan polimorfisme gen manusia (perubahan lokal) dan mutasi. Perubahan lokal kecil dalam urutan DNA dari gen yang berbeda adalah penyebab perkembangan berbagai penyakit.

Penyakit-penyakit ini dapat diturunkan. Metode PCR memungkinkan Anda untuk mengidentifikasi mutasi ini dan mencegah perkembangan atau meringankan perjalanan penyakit.

PCR digunakan untuk mendeteksi mutasi yang menyebabkan perkembangan penyakit seperti:

• pelanggaran pembekuan darah;
• penyakit kardiovaskular;
• gangguan metabolisme (misalnya, intoleransi laktosa);
• gangguan fungsi reproduksi (mutasi yang menyebabkan infertilitas pria);
• kanker payudara dan ovarium;
• penyakit autoimun.

Sampel untuk penelitian

Tergantung pada jenis infeksi yang terdeteksi, sampel untuk analisis dapat berupa sampel cairan biologis, jaringan, sel epitel:

• serum/plasma darah, perifer, darah tali pusat;
• sampel epitel mukosa (kanal serviks, vagina, uretra);
• kerokan konjungtiva, rongga hidung, orofaring;
• air mani, sekresi prostat;
• mengikis dari lesi erosif dan ulseratif;
• air seni;
• dahak;
• kotoran;
• cairan biologis lainnya (cairan ketuban, cairan serebrospinal, cairan ketuban, cairan artikular);
• bahan biopsi paru-paru, hati, saluran pencernaan;
• bilas bronkoalveolar.

Aturan untuk pengiriman cairan biologis untuk PCR

Reaksi berantai polimerase adalah metode yang membutuhkan kepatuhan ketat terhadap rekomendasi bahkan pada tahap pengumpulan bahan biologis.

Pengambilan sampel yang tidak memadai dapat menyebabkan hasil positif palsu atau negatif palsu.

• Jika media transportasi khusus diperlukan untuk transportasi dan penyimpanan bahan biologis sebelum analisis, disarankan untuk menggunakan solusi transportasi yang diproduksi oleh perusahaan yang sama yang memasok kit PCR uji.
• Pengambilan sampel untuk uji PCR dilakukan secara terpisah dari sampel yang ditujukan untuk penelitian lain. Instrumen steril sekali pakai, wadah dan sarung tangan digunakan untuk seleksi.
• Disarankan untuk mengambil sampel untuk analisis sebelum dimulainya terapi dan 2 minggu setelah terapi berakhir.
• Disarankan untuk mendonorkan darah di pagi hari dengan perut kosong. Seluruh darah disimpan dalam tabung antikoagulan (EDTA, garam natrium asam sitrat). Antikoagulan lain, seperti heparin, tidak diperbolehkan karena menghambat reaksi PCR. Serum disimpan tanpa antikoagulan.
• Saat mengumpulkan urin, perlu untuk mengumpulkan urin pagi (porsi pertama), sekitar 30-40 ml. Diperbolehkan untuk menyimpan sampel sampai dikirim ke laboratorium tidak lebih dari 2 jam.
• Sebelum mengumpulkan air liur, bilas mulut dengan garam. Disarankan untuk tidak makan selama 4 jam sebelum pengambilan sampel. Jumlah sampel adalah dari 3 hingga 5 ml. Air liur dikumpulkan segera sebelum analisis; bahan dapat disimpan beku pada suhu minus 20 ° C.
• Tabung sekali pakai digunakan untuk mengumpulkan sampel dahak. Volume sampel yang diperlukan adalah dari 5 hingga 10 ml. Sebelum dianalisis, sampel dapat disimpan pada suhu 4°C selama 24 jam.
• Cairan sinovial ditarik dengan jarum suntik. Disarankan untuk menggunakan peralatan steril sekali pakai untuk pengumpulan dan penyimpanan bahan. Volume sampel yang dibutuhkan adalah 1 ml.
• Untuk mengambil sampel epitel selaput lendir, probe (misalnya, dari viscose) atau cytobrush digunakan.

Bagaimana mempersiapkan analisis PCR

Pengumpulan bahan yang benar diperlukan untuk mendapatkan hasil pengujian yang benar, oleh karena itu disarankan untuk mematuhi aturan berikut:

• Disarankan untuk mengumpulkan bahan biologis selama infeksi akut, tetapi agen antibakteri tidak boleh dikonsumsi saat ini.
• Sebelum mengambil sampel dari vagina, disarankan untuk berhenti minum obat vagina apa pun, dan juga tidak melakukan prosedur seperti douching selama 24 jam.
• Sebelum mengambil sampel dari uretra, Anda harus menahan diri untuk tidak buang air kecil selama 1,5-2 jam, obati pintu masuk eksternal uretra dengan garam.
• Disarankan agar sampel urin diambil saat perut kosong di pagi hari.
• Sebelum mengumpulkan air liur, makanan, obat-obatan, dan alkohol dihentikan 12 jam sebelum pengambilan sampel. Sebelum pengambilan sampel, rongga mulut dan gigi dibersihkan dengan sikat gigi tanpa pasta, rongga mulut harus dibilas dengan air, tanpa menggunakan bahan tambahan. Air liur dikumpulkan dengan jarum suntik.
• Saat mengambil kerokan dari orofaring, jangan makan atau minum air selama 2 jam. Tidak disarankan untuk menggunakan semprotan tenggorokan, permen karet, tablet hisap, atau menyikat gigi.
• Saat mengumpulkan dahak, disarankan untuk memproses rongga mulut secara menyeluruh: gosok gigi, bilas mulut. Kumpulkan lendir pagi hari atau cairan purulen. Sampel 3 ml sudah cukup untuk pengujian. Untuk meningkatkan volume sekresi, Anda dapat mengambil inhalasi ekspektoran atau obat-obatan.
• Apusan dari konjungtiva mata diambil di sisi dalam kelopak mata bawah, tanpa menyentuh bulu mata.

Prosedur pengambilan apus (untuk wanita dan pria)

Saat memeriksa saluran urogenital pada wanita, pengikisan mukosa vagina, uretra, dan saluran serviks dilakukan. Sampel diambil sebelum inspeksi manual. Pengambilan sampel dilakukan dengan menggunakan probe steril dengan swab atau cytobrush.

Sebelum prosedur, area luar uretra dirawat dengan larutan steril, kelebihan lendir dikeluarkan dari vagina dan leher rahim. Probe dimasukkan ke dalam uretra atau ke dalam saluran serviks hingga kedalaman 0,5-1,5 cm. Materi dikumpulkan dengan gerakan rotasi lembut.

Apusan diambil dari bagian belakang vagina. Saat melepas probe, tidak disarankan untuk menyentuh dinding vagina dengannya.

Probe (area kerjanya) dicuci dalam tabung reaksi dengan cairan pengangkut, yang disediakan oleh produsen kit untuk diagnostik PCR, dan ditekan ke dinding tabung reaksi. Terkadang pabrikan kit merekomendasikan untuk mematahkan probe dan membiarkan bagian yang bekerja langsung di dalam tabung. Ini mengurangi kehilangan sampel.

Tidak disarankan untuk mengambil apusan untuk PCR setelah kolposkopi. Sebelum mengambil sampel bahan, disarankan untuk berhenti minum tablet dan obat-obatan vagina dalam 2-3 hari. Apusan diambil tidak lebih awal dari 2-3 hari setelah akhir aliran menstruasi.

Saat mengambil apusan dari pria, daerah luar uretra dirawat dengan larutan steril, dan kelebihan sekresi dihilangkan. Probe steril dimasukkan 3-4 cm untuk mengambil sampel. Bagian kerja dari probe dicuci dalam tabung reaksi dengan larutan transportasi.

Bagaimana tes PCR diuraikan

Dalam hasil tes PCR, selain nama analisis dan hasil tes, ditunjukkan: norma atau nilai referensi yang dengannya hasil yang diperoleh dapat dibandingkan:

Nama analisis	Hasil	Norma
DNA Chlamidia trachomatis	Positif	Negatif
DNA mikoplasma hominis	Negatif	Negatif

Hasil positif berarti ada DNA patogen dalam bahan biologis, hasil negatif berarti tidak ada.

Saat menilai viral load, DNA diukur. Dalam hal ini, tabel hasil berisi nilai numerik jumlah salinan DNA yang terdeteksi, misalnya:

Indeks	Hasil	Nilai referensi
Kuantifikasi DNA Virus Hepatitis B	4.3 * 10v 3 st.	<300 tidak signifikan secara klinis; > 300 positif

Dalam kasus analisis kualitatif dan kuantitatif, hasilnya dinilai oleh dokter yang merawat.

Saat menganalisis hasil yang diperoleh, kesalahan berikut sering ditemui:

• Tes PCR kontrol awal setelah akhir pemberian antibiotik (setelah 1-2 minggu). DNA agen infeksius tetap berada dalam tubuh pasien selama beberapa minggu setelah sel-sel agen infeksius dihancurkan dengan terapi. Oleh karena itu, hasil positif yang diperoleh adalah positif palsu, dan kesimpulan bahwa terapi tidak berhasil adalah keliru. Jika kita berbicara tentang agen penyebab infeksi pada epitel kulit, maka tes ini direkomendasikan untuk dilakukan tidak lebih awal dari sebulan setelah akhir perawatan.
• Saat menafsirkan analisis PCR dari beberapa infeksi, misalnya, infeksi sitomegalovirus, hasil positif tidak selalu berarti jalannya proses infeksi dan perlunya terapi. Hanya dalam 60% kasus dengan hasil PCR positif, pasien mengembangkan tanda-tanda klinis penyakit.
• Saat menafsirkan tes PCR untuk human papillomavirus tes positif dapat disalahartikan sebagai penyebab perkembangan proses onkologis, meskipun pada 90% pasien, infeksi HPV sembuh dalam 6-24 bulan. Jika hasilnya positif, perlu dilakukan studi epitel serviks, dan baru kemudian menilai risiko berkembangnya kanker.
• Dalam studi infeksi saluran urogenital pada wanita, dianjurkan tidak hanya untuk menentukan infeksi oportunistik, tetapi juga untuk membandingkan jumlahnya dengan jumlah Lactovacillus, yang dianggap sebagai perwakilan utama mikroflora normal vagina. Analisis semacam itu memungkinkan Anda untuk menentukan disbiosis, menafsirkan hasil tes PCR dengan benar, dan meresepkan terapi.

Reaksi berantai polimerase adalah metode yang digunakan untuk mempelajari jumlah virus dan bakteri secara kuantitatif. Harus diingat bahwa untuk beberapa infeksi tidak ada peraturan yang jelas yang memungkinkan Anda untuk menentukan signifikansi klinis dari hasil yang diperoleh.

Ini berarti bahwa interpretasi hasil bersifat subjektif dan bisa salah. Jadi, misalnya, oportunistik Ureaplasma, mikoplasma, Gardnerella dengan tidak adanya keluhan dan tanda-tanda klinis peradangan, mereka tidak memerlukan terapi. Resep terapi yang tidak masuk akal menyebabkan peningkatan kasus dysbiosis dan vaginosis.

Video tentang analisis PCR

Diagnosis PCR infeksi virus: penjelasan metode: