Polymerasekettingreactie (PCR). Wat is het, een methode in microbiologie, geneeskunde, cultuur, uitstrijkje?

Polymerasekettingreactie (PCR) is een moderne laboratoriummethode voor het genereren van een groot aantal kopieën van afzonderlijke secties van nucleïnezuren (DNA of RNA). PCR wordt op veel gebieden van biologie en geneeskunde gebruikt. In de medische diagnostiek wordt deze methode gebruikt om vast te stellen: infectieziekten.

In de moleculaire biologie kan het doel van kopiëren een stuk DNA zijn om de functie van een bepaald gen of andere experimenten te bestuderen (genen klonen, andere genen introduceren, mutaties identificeren). Bij forensisch onderzoek wordt DNA onderzocht op het genetisch materiaal van verdachten op de plaats delict.

Wat is analyse?

Bij de diagnose van ziekten met behulp van de PCR-methode wordt een specifiek deel van het DNA van het infectieuze agens geïsoleerd in het biologische materiaal van de patiënt. Als deze site wordt gevonden, is dit een direct bewijs van de aanwezigheid van de ziekteverwekker in het lichaam van de patiënt.

PCR kan ook veranderingen in het genetische materiaal van de patiënt detecteren., die helpen bij het bepalen van aangeboren ziekten, veranderingen in het immuunsysteem, aanleg voor verschillende ziekten.

Bij het uitvoeren van PCR-analyse wordt een bepaald deel van het DNA- of RNA-molecuul van de veroorzaker van de ziekte in het biologische materiaal door speciale methoden uit het monster geïsoleerd. Vervolgens wordt deze site vele malen gedupliceerd met behulp van enzymen.

De hoeveelheid DNA wordt gesynthetiseerd die visueel kan worden vastgelegd. Slechts een bepaald deel van het DNA-molecuul wordt gekopieerd.

PCR vereist de volgende componenten:

• DNA-sjabloon (een stukje DNA dat herhaaldelijk wordt gekopieerd en geïdentificeerd),
• primers (speciaal gesynthetiseerde enkelstrengs korte DNA-moleculen die nodig zijn voor het voorbereiden van DNA-synthese),
• DNA-polymerase (een enzym dat de reactie van DNA-polymerisatie katalyseert), deoxynucleosidetrifosfaten (stikstofbasen zijn de moleculen waaruit DNA bestaat).
• Overige componenten (magnesiumionen, bufferoplossing).

Polymerasekettingreactie is een methode waarvoor speciale apparatuur (versterker) nodig is, deze bestaat uit de volgende stappen:

• Denaturatie van het matrijs-DNA, waarbij dubbelstrengs DNA in twee strengen wordt gesplitst. Deze fase duurt 30-40 seconden.
• Hechting van primers aan specifieke DNA-gebieden vindt plaats binnen 20-60 seconden.
• Polymerisatie is de synthese van nieuwe DNA-strengen met behulp van een enzym.

Na herhaalde herhaling van deze fasen wordt het vereiste aantal kopieën gesynthetiseerd (na 20 cycli bereikt het aantal kopieën meer dan een miljoen).

Registratie van virus-DNA wordt uitgevoerd na amplificatie in een speciaal apparaat (indien PCR met detectie in eindpunt) of direct in de versterker tijdens de reactie (als realtime PCR wordt gebruikt) fluorescerend methode.

Waar kan ik inchecken, hoeveel kost het?

PCR-analyse kan worden uitgevoerd in elk medisch laboratorium dat voor deze analyse is geaccrediteerd.

De kosten van de test zijn afhankelijk van het type infectie:

Laboratorium	Infectie / kosten
KDL	Cytomegalovirus-DNA - 230 roebel Herpes simplex-virus type 6 DNA - 250 roebel RNA-coronavirus SARS-CoV-2/1600 roebel.
Hemotest	Cytomegalovirus-DNA - 250 roebel DNA van het herpesvirus type 6 - 240 roebel. RNA-coronavirus SARS-CoV-2 - 1700 roebel.
Invitro	Cytomegalovirus-DNA in het bloed - 400 roebel. DNA van humaan herpesvirus 1 en 2 typen bij het afschrapen van epitheelcellen van de huid - 570 roebel. RNA-coronavirus SARS-CoV-2 - 1990 roebel.
Stadslab	Cytomegalovirus-DNA - 240 roebel Menselijk herpesvirus type 6 DNA - 290 roebel RNA-coronavirus SARS-CoV-2 - 1800 roebel.

Rassen van PCR

Polymerasekettingreactie is een methode waarvoor verschillende methoden zijn ontwikkeld om de analyse op te zetten.

Deze methoden zijn ontworpen om het risico op fout-positieve en fout-negatieve resultaten te verminderen, of om kwantitatief uit te voeren of kwalitatieve analyse, evenals voor de bepaling van verschillende nucleïnezuren: DNA (deoxyribonucleïnezuur) of RNA (ribonucleïnezuur).

Volgens de methode voor het bepalen van de reactieproducten worden twee soorten PCR onderscheiden:

• Realtime PCR - versterking en detectie worden gelijktijdig in één apparaat uitgevoerd. Met deze modificatie van PCR is het mogelijk om de hoeveelheid van de gewenste DNA-sequentie bij elke cyclus van DNA-synthese te bepalen.
• Eindpunt PCR - een soort PCR-analyse, waarbij de resultaten worden vastgelegd door de methode van fluorescentie in een speciaal apparaat, na het einde van de polymerasekettingreactie.

In de laboratoriumpraktijk zijn er verschillende manieren om de analyse op te zetten, zoals:

• Hot-start PCR. Het bijzondere van deze methode is dat de reactie pas begint als een bepaalde temperatuur is bereikt. De reactiecomponenten (vooral enzymen) worden geblokkeerd en beginnen pas bij een bepaalde temperatuur te werken. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van de analyse. Als het reactiemengsel geleidelijk wordt verwarmd, bestaat het risico van de vorming van bijproducten van de reactie en dus onnauwkeurige analyseresultaten.
• Voor de detectie van virussen met een RNA-genoombijvoorbeeld hepatitis C-type of humaan immunodeficiëntievirus, een methode genaamd reverse transcription PCR (RT-PCR) wordt gebruikt. Het RNA van het virus wordt eerst omgezet in een complementair DNA-molecuul. Het resulterende DNA wordt vervolgens gebruikt als een matrijs voor PCR.
• Multi-primer PCR - een methode om de reactie uit te voeren, waarbij meerdere DNA-sequenties tegelijkertijd in één monster worden gekopieerd. Met deze methode kunt u verbruiksgoederen verminderen en de analysekosten verlagen.
• PCR-methode met behulp van NASBA-technologie (amplificatie op basis van nucleïnezuursequentie) is dat het RNA van het virus wordt gebruikt als een sjabloon voor het kopiëren van genetisch materiaal. Met behulp van speciale enzymen (transcriptase, RNA-polymerase, RNase) wordt in het reactiemedium complementair DNA (cDNA) gevormd, evenals een complex van RNA- en cDNA-moleculen. Het verschil tussen deze modificatie en standaard PCR is dat niet DNA, maar RNA wordt geaccumuleerd als genetisch materiaal. Het verschil tussen deze methode en de RT-PCR-methode is dat RNA niet alleen een matrijs is voor cDNA-synthese, maar ook een amplificatieproduct (dat wil zeggen, het eindproduct van de reactie).

DNA-moleculen worden gedurende zeer lange tijd in het lichaam vernietigd en kunnen bij een patiënt worden gedetecteerd, zelfs als antivirale of antibiotische therapie al heeft gewerkt. Daarom laat de standaard PCR-methode het niet toe om de effectiviteit van therapie te evalueren.

In tegenstelling tot DNA kunnen RNA-moleculen uitsluitend worden geïsoleerd uit levende cellen of virussen, en na de vernietiging van levende cellen wordt het RNA-molecuul ook snel vernietigd. Met deze wijziging kunt u het effect van de therapie al regelen op het moment van implementatie.

Voor- en nadelen van PCR

Vergeleken met andere laboratoriummethoden voor het opsporen van infecties heeft de PCR-methode verschillende voordelen:

• PCR-methode is een directe methode bepaling van het genetisch materiaal van een virus of bacterie in een monster. In tegenstelling tot andere methoden die indirecte tekenen van infectie bepalen, geeft de PCR-test direct de aanwezigheid van een virus in het lichaam aan.
• Hoge specificiteit van de methode, dat wil zeggen, het vermogen om een ​​specifiek pathogeen te identificeren hangt samen met het feit dat genetisch materiaal wordt bepaald dat uniek is voor een bepaald organisme (virus, bacterie, microscopische schimmel). Daarom is de specificiteit van deze methode bijna 100%.
• Hoge gevoeligheid van de methode (ook dicht bij 100%) is de hoeveelheid monster die met deze methode kan worden bepaald. Zelfs een kleine hoeveelheid virus- of bacteriële moleculen in biologisch materiaal wordt bepaald. Dit maakt het mogelijk om de drager van het virus al vóór het begin van de symptomen te identificeren.
• De methode is universeel voor het detecteren van DNA / RNA van virussen of bacteriën. Met behulp van PCR is het mogelijk om eventuele infecties, maar ook chronische ziekten vast te stellen.
• Snelle analysemethode, duur is ongeveer 4-6 uur.

Gebreken:

• De polymerasekettingreactie is een methode voor de directe detectie van het genetische materiaal (DNA) van de ziekteverwekker en staat niet toe evalueer de effectiviteit van therapie, aangezien het DNA-molecuul lange tijd niet wordt vernietigd, zelfs als de therapie dat al is werkte.
• De hoge gevoeligheid van de methode kan het nadeel zijn. Na voltooiing van de therapie detecteert PCR bijvoorbeeld nog steeds het DNA van dode cellen bij een gezonde patiënt, waardoor een vals-positief resultaat wordt verkregen.
• Verschillende fabrikanten van PCR-tests kunnen dezelfde infecties detecteren met verschillende systemen. Daarom kunnen de resultaten van het bepalen van dezelfde infectie in laboratoria verschillen. Het wordt aanbevolen om dynamische kwantitatieve tests in hetzelfde laboratorium uit te voeren.
• Sommige tests, vooral genetische tests, kunnen behoorlijk duur zijn.
• Voor het uitvoeren van PCR-tests zijn dure apparatuur, reagentia en goed opgeleid gekwalificeerd personeel vereist. De nauwkeurigheid van de analyseresultaten is afhankelijk van de kwaliteit van de reagentia en de wijze van biologische monstername.

Om vast te stellen welke infecties PCR geschikt is (toepassingsgebied van de methode in de geneeskunde)

PCR-methode wordt gebruikt voor de identificatie, dat wil zeggen de kwalitatieve bepaling, evenals voor de kwantitatieve bepaling van DNA en RNA van pathogenen van verschillende infecties:

• humaan immunodeficiëntievirus (HIV);
• hepatitisvirussen A, B, C, D, G;
• pathogenen die ziekten van het urogenitale kanaal veroorzaken, bijvoorbeeld Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• pathogenen die dysbiose van het urogenitale kanaal en candidiasis veroorzaken, bijvoorbeeld micro-organismen zoals Saccharimonas aalborgensis, microscopische schimmels van het geslacht Candida;
• veroorzakers van humaan papillomavirusinfecties;
• TORCH- en herpesvirusinfecties;
• pathogenen van natuurlijke focale infecties die kunnen worden verspreid door vogels, dieren, bloedzuigende insecten, bijvoorbeeld borreliose, encefalitis, West-Nijlkoorts;
• gastro-intestinale infecties;
• veroorzakers van tuberculose;
• luchtweginfecties (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• nosocomiale infecties (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

Ook wordt de viral load bepaald door de PCR-methode, wordt de dynamiek van de ziekte en het effect van de therapie onderzocht.

De polymerasekettingreactie in de geneeskunde heeft nog een andere belangrijke toepassing: het is de bepaling van polymorfismen van menselijke genen (lokale veranderingen) en mutaties. Kleine lokale veranderingen in de DNA-sequentie van verschillende genen zijn de oorzaak van het ontstaan ​​van verschillende ziekten.

Deze ziekten kunnen worden overgeërfd. Met de PCR-methode kunt u deze mutaties identificeren en de ontwikkeling van ziekten voorkomen of het beloop verlichten.

PCR wordt gebruikt om mutaties te detecteren die de ontwikkeling van ziekten veroorzaken, zoals:

• schending van de bloedstolling;
• hart-en vaatziekten;
• stofwisselingsstoornissen (bijvoorbeeld lactose-intolerantie);
• verminderde reproductieve functie (mutaties die mannelijke onvruchtbaarheid veroorzaken);
• borst- en eierstokkanker;
• auto-immuunziekten.

Monsters voor onderzoek

Afhankelijk van het type infectie dat wordt gedetecteerd, kunnen monsters voor analyse monsters zijn van biologische vloeistoffen, weefsels, epitheelcellen:

• bloedserum / plasma, perifeer, navelstrengbloed;
• monsters van slijmvliesepitheel (cervicaal kanaal, vagina, urethra);
• schaafwonden van de conjunctiva, neusholte, orofarynx;
• sperma, prostaatsecretie;
• schrapen van erosieve en ulceratieve laesies;
• urine;
• sputum;
• ontlasting;
• andere biologische vloeistoffen (vruchtwater, hersenvocht, vruchtwater, gewrichtsvloeistof);
• biopsiemateriaal van de longen, lever, maag-darmkanaal;
• bronchoalveolaire lavage.

Regels voor de levering van biologische vloeistoffen voor PCR

Polymerasekettingreactie is een methode die strikte naleving van aanbevelingen vereist, zelfs in het stadium van het verzamelen van biologisch materiaal.

Onvoldoende steekproeven kunnen leiden tot fout-positieve of fout-negatieve resultaten.

• Indien een speciaal transportmedium nodig is voor het transport en de opslag van biologisch materiaal voorafgaand aan de analyse, het wordt aanbevolen om een ​​transportoplossing te gebruiken die is vervaardigd door hetzelfde bedrijf dat de PCR-kits levert toets.
• Bemonstering voor PCR-test wordt afzonderlijk uitgevoerd van monsters die bedoeld zijn voor andere onderzoeken. Voor de selectie worden steriele wegwerpinstrumenten, containers en handschoenen gebruikt.
• Het wordt aanbevolen om monsters te nemen voor analyse vóór het begin van de therapie en 2 weken na het einde ervan.
• Het wordt aanbevolen om 's ochtends op een lege maag bloed te doneren. Volbloed wordt opgeslagen in antistollingsbuisjes (EDTA, citroenzuurnatrium). Andere anticoagulantia, zoals heparine, zijn niet toegestaan ​​omdat ze de PCR-reactie remmen. Serum wordt zonder antistollingsmiddel bewaard.
• Bij het verzamelen van urine is het noodzakelijk om de ochtendurine (eerste portie) op te vangen, ongeveer 30-40 ml. Het monster mag worden bewaard tot het maximaal 2 uur naar het laboratorium wordt gestuurd.
• Spoel de mond met zoutoplossing voordat u speeksel opvangt. Het wordt aanbevolen om gedurende 4 uur niet te eten voordat u het monster neemt. De hoeveelheid monster is van 3 tot 5 ml. Het speeksel wordt vlak voor de analyse verzameld; het materiaal kan ingevroren bewaard worden bij min 20°C.
• Wegwerpbuisjes worden gebruikt om sputummonsters te verzamelen. Het vereiste monstervolume is van 5 tot 10 ml. Voor analyse kan het monster 24 uur worden bewaard bij 4 ° C.
• Het gewrichtsvocht wordt opgezogen met een injectiespuit. Het wordt aanbevolen om steriele wegwerpapparatuur te gebruiken voor het verzamelen en opslaan van materiaal. Het benodigde monstervolume is 1 ml.
• Voor het nemen van een monster van het epitheel van de slijmvliezen worden sondes (bijvoorbeeld uit viscose) of cytoborstels gebruikt.

Voorbereiden op PCR-analyse

Het correct verzamelen van materiaal is noodzakelijk om correcte testresultaten te verkrijgen, daarom wordt aanbevolen om de volgende regels in acht te nemen:

• Het wordt aanbevolen om biologisch materiaal te verzamelen tijdens een acuut infectieverloop, maar antibacteriële middelen mogen op dit moment niet worden gebruikt.
• Voordat u monsters uit de vagina neemt, wordt aanbevolen om te stoppen met het nemen van vaginale medicijnen en ook om 24 uur lang geen procedures zoals douchen uit te voeren.
• Voordat u een monster uit de urethra neemt, moet u 1,5-2 uur niet plassen, de externe ingang van de urethra behandelen met zoutoplossing.
• Het wordt aanbevolen om urinemonsters 's ochtends op een lege maag te verzamelen.
• Voor het verzamelen van speeksel, voedsel, medicatie en alcohol worden 12 uur voorafgaand aan de monsterafname stopgezet. Alvorens het monster te nemen, worden de mondholte en tanden gereinigd met een tandenborstel zonder pasta, de mondholte moet grondig worden gespoeld met water, zonder het gebruik van extra middelen. Speeksel wordt opgevangen met een spuit.
• Wanneer u schraapsel uit de orofarynx neemt, mag u gedurende 2 uur geen water eten of drinken. Het wordt niet aanbevolen om keelsprays, kauwgom, zuigtabletten of tandenpoetsen te gebruiken.
• Bij het verzamelen van sputum wordt aanbevolen om de mondholte grondig te verwerken: poets je tanden, spoel je mond. Verzamel ochtendslijm of etterende afscheiding. Een monster van 3 ml is voldoende om te testen. Om het volume van secreties te vergroten, kunt u slijmoplossende inhalaties of medicijnen nemen.
• Een uitstrijkje van het bindvlies van het oog wordt aan de binnenkant van het onderste ooglid genomen, zonder de wimpers aan te raken.

Uitstrijkje (voor dames en heren)

Bij onderzoek van het urogenitale kanaal bij vrouwen wordt het vaginale slijmvlies, de urethra en het cervicale kanaal afgeschraapt. Voorafgaand aan handmatige inspectie worden monsters genomen. De bemonstering wordt uitgevoerd met steriele sondes met een wattenstaafje of cytoborstel.

Vóór de procedure wordt het buitenste deel van de urethra behandeld met een steriele oplossing, overtollig slijm wordt verwijderd uit de vagina en de baarmoederhals. De sonde wordt in de urethra of in het cervicale kanaal ingebracht tot een diepte van 0,5-1,5 cm. Het materiaal wordt verzameld met zachte draaibewegingen.

Er wordt een uitstrijkje van de achterkant van de vagina genomen. Bij het verwijderen van de sonde wordt het afgeraden om de wanden van de vagina ermee aan te raken.

De sonde (zijn werkgebied) wordt gewassen in een reageerbuis met een transportvloeistof, die wordt geleverd door de fabrikant van een kit voor PCR-diagnostiek, en tegen de wanden van de reageerbuis gedrukt. Soms raadt de fabrikant van de kit aan om de sonde te breken en het werkende deel direct in de buis te laten. Dit vermindert monsterverlies.

Het wordt niet aanbevolen om uitstrijkjes te maken voor PCR na colposcopie. Voordat u het materiaal inneemt, wordt aanbevolen om binnen 2-3 dagen te stoppen met het innemen van vaginale tabletten en medicijnen. Het uitstrijkje wordt niet eerder dan 2-3 dagen na het einde van de menstruatie genomen.

Bij het nemen van een uitstrijkje van mannen wordt het buitenste deel van de urethra behandeld met een steriele oplossing en worden overtollige secreties verwijderd. Een steriele sonde wordt 3-4 cm ingebracht om een ​​monster te verzamelen. Het werkende deel van de sonde wordt gewassen in een reageerbuis met een transportoplossing.

Hoe worden PCR-tests ontcijferd?

In de resultaten van de PCR-test wordt naast de naam van de analyse en de testresultaten aangegeven norm- of referentiewaarden waarmee het verkregen resultaat kan worden vergeleken:

Analyse naam	Resultaat	Norm
Chlamidia trachomatis-DNA	Positief	Negatief
Micoplasma hominis-DNA	Negatief	Negatief

Een positief resultaat betekent de aanwezigheid van een pathogeen DNA in het biologische materiaal, een negatief resultaat betekent de afwezigheid ervan.

Bij het beoordelen van de virale belasting wordt DNA gekwantificeerd. In dit geval bevat de resultatentabel de numerieke waarde van het aantal kopieën van het gedetecteerde DNA, bijvoorbeeld:

Inhoudsopgave	Resultaat	Referentiewaarden
Kwantificering van hepatitis B-virus-DNA	4.3 * 10v 3 st.	<300 klinisch niet significant; > 300 positief

Bij kwalitatieve en kwantitatieve analyse worden de resultaten beoordeeld door de behandelend arts.

Bij het analyseren van de verkregen resultaten komen de volgende fouten vaak voor:

• Vroege controle PCR-test na het einde van de antibioticakuur (na 1-2 weken). Het DNA van het infectieuze agens blijft enkele weken in het lichaam van de patiënt nadat de cellen van het infectieuze agens door therapie zijn vernietigd. Daarom is het verkregen positieve resultaat vals positief en is de conclusie dat de therapie niet werkte onjuist. Als we het hebben over veroorzakers van infectie op het huidepitheel, wordt aanbevolen om de test niet eerder dan een maand na het einde van de behandeling uit te voeren.
• Bij het interpreteren van PCR-analyse van sommige infecties, bijvoorbeeld cytomegalovirusinfectie, betekent een positief resultaat niet altijd het verloop van het infectieuze proces en de noodzaak van therapie. In slechts 60% van de gevallen met een positief PCR-resultaat ontwikkelen patiënten klinische symptomen van de ziekte.
• Bij het interpreteren van PCR-tests voor humaan papillomavirus een positieve test kan ten onrechte worden geïnterpreteerd als de oorzaak van de ontwikkeling van oncologische processen, hoewel bij 90% van de patiënten de HPV-infectie binnen 6-24 maanden verdwijnt. Als het resultaat positief is, is het noodzakelijk om het epitheel van de baarmoederhals te onderzoeken en pas daarna het risico op kanker te beoordelen.
• In onderzoeken naar infecties van het urogenitale kanaal bij vrouwen wordt het aanbevolen om niet alleen opportunistische infecties vast te stellen, maar ook om hun aantal te vergelijken met het aantal Lactovacillus, die worden beschouwd als de belangrijkste vertegenwoordigers van de normale microflora van de vagina. Met een dergelijke analyse kunt u dysbiose bepalen, de resultaten van de PCR-test correct interpreteren en therapie voorschrijven.

Polymerasekettingreactie is een methode die wordt gebruikt om de virale en bacteriële belasting te kwantificeren. Houd er rekening mee dat er voor sommige infecties geen duidelijke regelgeving is waarmee u de klinische betekenis van de verkregen resultaten kunt bepalen.

Dit betekent dat de interpretatie van de resultaten subjectief is en foutief kan zijn. Dus, bijvoorbeeld, opportunistisch Ureaplasma, Micoplasma, Gardnerella bij afwezigheid van klachten en klinische tekenen van ontsteking, hebben ze geen therapie nodig. Onredelijk voorschrijven van therapie leidt tot een toename van gevallen van dysbiose en vaginose.

Video over PCR-analyse

PCR-diagnostiek van virale infectie: uitleg van de methode: