Polymerasekjedereaksjon (PCR). Hva er det, en metode innen mikrobiologi, medisin, kultur, smøre

Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en moderne laboratoriemetode for å generere et stort antall kopier av individuelle deler av nukleinsyrer (DNA eller RNA). PCR brukes på mange områder innen biologi og medisin. I medisinsk diagnostikk brukes denne metoden for å bestemme Smittsomme sykdommer.

I molekylærbiologi kan formålet med kopiering være et stykke DNA for å studere funksjonen til et bestemt gen eller andre eksperimenter (kloning av gener, innføring av andre gener, identifisering av mutasjoner). I en rettsmedisinsk undersøkelse blir DNA undersøkt for å matche arvestoffet til mistenkte på åstedet.

Hva er analyse?

I diagnosen sykdommer ved bruk av PCR -metoden isoleres en spesifikk seksjon av DNA -en til det smittestoffet i pasientens biologiske materiale. Hvis dette stedet blir funnet, er dette et direkte bevis på tilstedeværelsen av patogenet i pasientens kropp.

PCR kan også oppdage endringer i pasientens genetiske materiale., som hjelper til med å bestemme medfødte sykdommer, endringer i immunsystemet, disposisjon for forskjellige sykdommer.

Når du utfører PCR -analyse, isoleres en bestemt del av DNA- eller RNA -molekylet til årsakssykdommen til sykdommen i det biologiske materialet fra prøven ved spesielle metoder. Da blir dette nettstedet duplisert mange ganger ved hjelp av enzymer.

Mengden DNA blir syntetisert som kan registreres visuelt. Bare en viss del av DNA -molekylet blir kopiert.

PCR krever følgende komponenter:

• DNA -mal (et stykke DNA som blir kopiert og identifisert gjentatte ganger),
• primere (spesielt syntetiserte enkeltstrengede korte DNA-molekyler som trengs for å frø DNA-syntese),
• DNA -polymerase (et enzym som katalyserer reaksjonen av DNA -polymerisering), deoksynukleosidtrifosfater (nitrogenholdige baser er molekylene som danner DNA).
• Andre komponenter (magnesiumioner, bufferløsning).

Polymerasekjedereaksjon er en metode som krever spesialutstyr (forsterker), den består av følgende trinn:

• Denaturering av mal-DNA, der dobbeltstrenget DNA spaltes i to tråder. Denne etappen varer i 30-40 sekunder.
• Festing av primere til spesifikke områder av DNA skjer innen 20-60 sekunder.
• Polymerisering er syntesen av nye DNA -tråder ved hjelp av et enzym.

Etter gjentatt gjentagelse av disse stadiene syntetiseres det nødvendige antallet kopier (etter 20 sykluser når antallet kopier mer enn en million).

Registrering av virus -DNA utføres etter amplifikasjon i en spesiell enhet (hvis PCR med deteksjon i endepunkt) eller direkte i forsterkeren under reaksjonen (hvis sanntids PCR brukes) fluorescerende metode.

Hvor kan jeg sjekke inn, hvor mye koster det

PCR -analyse kan utføres i ethvert medisinsk laboratorium som er akkreditert for denne analysen.

Kostnaden for testen avhenger av type infeksjon:

Laboratorium	Smitte / kostnad
KDL	Cytomegalovirus DNA - 230 rubler DNA av herpesvirus type 6 - 250 rubler. RNA coronavirus SARS-CoV-2/1600 rubler.
Hemotest	Cytomegalovirus DNA - 250 rubler DNA av herpesvirus type 6 - 240 rubler. RNA coronavirus SARS-CoV-2-1700 rubler.
Invitro	Cytomegalovirus -DNA i blodet - 400 rubler. DNA fra menneskelig herpesvirus 1 og 2 typer ved skraping av hudens epitelceller - 570 rubler. RNA coronavirus SARS-CoV-2-1990 rubler.
Citylab	Cytomegalovirus DNA - 240 rubler DNA av det humane herpesvirus type 6 - 290 rubler. RNA coronavirus SARS-CoV-2-1800 rubler.

Varianter av PCR

Polymerasekjedereaksjon er en metode som har blitt utviklet forskjellige metoder for å sette opp analysen.

Disse metodene ble designet for å redusere risikoen for falske positive og falske negative resultater, eller for å utføre kvantitative eller kvalitativ analyse, samt for bestemmelse av forskjellige nukleinsyrer: DNA (deoksyribonukleinsyre) eller RNA (ribonukleinsyre).

I henhold til metoden for å bestemme reaksjonsproduktene, skilles to typer PCR:

• Sanntids PCR - forsterkning og deteksjon utføres samtidig i en enhet. Med denne modifikasjonen av PCR er det mulig å bestemme mengden av ønsket DNA -sekvens ved hver syklus av DNA -syntese.
• Sluttpunkt-PCR - en slags PCR -analyse, der resultatene registreres ved fluorescensmetoden i en spesiell enhet, etter at polymerasekjedereaksjonen er avsluttet.

I laboratoriepraksis er det forskjellige måter å sette opp analysen på, for eksempel:

• Varmstart PCR. Det særegne ved denne metoden er at reaksjonen bare starter når en viss temperatur er nådd. Reaksjonskomponentene (spesielt enzymer) blokkeres og begynner å fungere bare ved en viss temperatur. Denne metoden forbedrer nøyaktigheten av analysen. Hvis reaksjonsblandingen varmes gradvis opp, er det fare for dannelse av reaksjonsbiprodukter og derfor unøyaktige analyseresultater.
• For påvisning av virus med et RNA -genomfor eksempel hepatitt C-type eller humant immunsviktvirus, brukes en metode som kalles revers transkripsjon PCR (RT-PCR). RNA for viruset blir først omdannet til et komplementært DNA -molekyl. Det resulterende DNA brukes deretter som en mal for PCR.
• Multi-primer PCR - en metode for å utføre reaksjonen, der flere DNA -sekvenser kopieres samtidig i en prøve. Denne metoden lar deg redusere forbruksvarer og redusere kostnadene for analyse.
• PCR -metode ved bruk av NASBA -teknologi (Nukleinsyresekvensbasert amplifikasjon) er at virusets RNA brukes som en mal for kopiering av genetisk materiale. Ved hjelp av spesielle enzymer (transkriptase, RNA -polymerase, RNase) dannes komplementært DNA (cDNA) i reaksjonsmediet, så vel som et kompleks av RNA- og cDNA -molekyler. Forskjellen mellom denne modifikasjonen og standard PCR er at ikke DNA, men RNA akkumuleres som genetisk materiale. Forskjellen mellom denne metoden og RT-PCR-metoden er at RNA ikke bare er en mal for cDNA-syntese, men også et amplifikasjonsprodukt (det vil si sluttproduktet av reaksjonen).

DNA -molekyler ødelegges i kroppen i svært lang tid og kan påvises hos en pasient selv om antiviral eller antibiotisk terapi allerede har virket. Derfor tillater ikke standard PCR -metode å evaluere effektiviteten av terapien.

I motsetning til DNA kan RNA -molekyler utelukkende isoleres fra levende celler eller virus, og etter ødeleggelse av levende celler blir RNA -molekylet også raskt ødelagt. Denne modifikasjonen lar deg kontrollere effekten av terapi allerede på tidspunktet for implementeringen.

Fordeler og ulemper ved PCR

Sammenlignet med andre laboratoriemetoder for å påvise infeksjoner, har PCR -metoden flere fordeler:

• PCR -metoden er en direkte metode bestemmelse av det genetiske materialet til et virus eller en bakterie i en prøve. I motsetning til andre metoder som bestemmer indirekte tegn på infeksjon, indikerer PCR -testen direkte tilstedeværelsen av et virus i kroppen.
• Høy spesifisitet av metoden, det vil si evnen til å identifisere et spesifikt patogen er forbundet med det faktum at genetisk materiale bestemmes som er unikt for en gitt organisme (virus, bakterier, mikroskopisk sopp). Derfor er spesifisiteten til denne metoden nær 100%.
• Høy følsomhet for metoden (også nær 100%) er mengden prøve som kan bestemmes med denne metoden. Selv en liten mengde virus eller bakteriemolekyler i biologisk materiale bestemmes. Dette gjør det mulig å identifisere bæreren av viruset allerede før symptomene begynner.
• Metoden er universell for å påvise DNA / RNA for virus eller bakterier. Ved hjelp av PCR er det mulig å bestemme eventuelle infeksjoner, så vel som kroniske sykdommer.
• Rask analysemetode, varigheten er omtrent 4-6 timer.

Feil:

• Polymerasekjedereaksjonen er en metode for direkte påvisning av patogenets genetiske materiale (DNA), og det tillater det ikke vurdere effektiviteten av terapien, siden DNA -molekylet ikke blir ødelagt på lenge, selv om terapien allerede er det jobbet.
• Den høye følsomheten til metoden kan være dens ulempe. For eksempel, etter avsluttet behandling, oppdager PCR fortsatt DNA fra døde celler i en frisk pasient, og får dermed et falskt positivt resultat.
• Ulike produsenter av PCR -tester kan oppdage de samme infeksjonene ved hjelp av forskjellige systemer. Derfor kan resultatene av å bestemme den samme infeksjonen i laboratorier variere. Det anbefales å utføre dynamiske kvantitative tester i det samme laboratoriet.
• Noen tester, spesielt genetiske tester, kan være ganske dyre.
• For å utføre PCR-tester kreves dyrt utstyr, reagenser og godt trent kvalifisert personell. Nøyaktigheten av analyseresultatene avhenger av kvaliteten på reagensene og metoden for å ta biologiske prøver.

For å identifisere hvilke infeksjoner PCR er egnet (anvendelsesområde for metoden i medisin)

PCR -metode brukes for identifisering, det vil si den kvalitative bestemmelsen, så vel som for den kvantitative bestemmelsen av DNA og RNA for patogener ved forskjellige infeksjoner:

• humant immunsviktvirus (HIV);
• hepatittvirus A, B, C, D, G;
• patogener som forårsaker sykdommer i det urogenitale området, for eksempel Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• patogener som forårsaker dysbiose i det urogenitale området og candidiasis, for eksempel mikroorganismer som Saccharimonas aalborgensis, mikroskopiske sopp av slekten Candida;
• forårsakende agenter for humant papillomavirusinfeksjon;
• TORCH og Herpesvirus infeksjoner;
• patogener av naturlige fokale infeksjoner som kan spres av fugler, dyr, blodsugende insekter, for eksempel borreliose, encefalitt, vestnilfeber;
• gastrointestinale infeksjoner;
• forårsakende agenter for tuberkulose;
• luftveisinfeksjoner (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• nosokomielle infeksjoner (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

Viral belastning bestemmes også av PCR -metoden, sykdynamikken og effekten av terapien blir undersøkt.

Polymerasekjedereaksjonen i medisin har en annen viktig anvendelse - det er bestemmelsen av polymorfismer av menneskelige gener (lokale endringer) og mutasjoner. Mindre lokale endringer i DNA -sekvensen til forskjellige gener er årsaken til utviklingen av forskjellige sykdommer.

Disse sykdommene kan gå i arv. PCR -metoden lar deg identifisere disse mutasjonene og forhindre utvikling eller lindre sykdomsforløpet.

PCR brukes til å oppdage mutasjoner som forårsaker utvikling av sykdommer som:

• brudd på blodpropp;
• hjerte- og karsykdommer;
• metabolske forstyrrelser (for eksempel laktoseintoleranse);
• nedsatt reproduktiv funksjon (mutasjoner som forårsaker mannlig infertilitet);
• bryst- og eggstokkreft;
• autoimmune sykdommer.

Prøver for forskning

Avhengig av typen infeksjon som oppdages, kan prøver for analyse være prøver av biologiske væsker, vev, epitelceller:

• blodserum / plasma, perifert, navlestrengsblod;
• prøver av slimhinneepitel (livmorhalskanal, skjede, urinrør);
• avskrapning av bindehinnen, nesehulen, orofarynx;
• sæd, prostata sekresjon;
• skraping fra erosive og ulcerative lesjoner;
• urin;
• sputum;
• avføring;
• andre biologiske væsker (fostervann, cerebrospinalvæske, fostervann, leddvæske);
• biopsimateriale i lungene, leveren, mage -tarmkanalen;
• bronkoalveolær skylling.

Regler for levering av biologiske væsker for PCR

Polymerasekjedereaksjon er en metode som krever streng overholdelse av anbefalinger selv på tidspunktet for innsamling av biologisk materiale.

Utilstrekkelig prøvetaking kan føre til falske positive eller falske negative resultater.

• Hvis et spesielt transportmedium er nødvendig for transport og lagring av biologisk materiale før analyse, det anbefales å bruke en transportløsning produsert av samme selskap som leverer PCR -settene test.
• Prøvetaking for PCR -test utføres separat fra prøver beregnet for andre studier. Sterile engangsinstrumenter, beholdere og hansker brukes til valg.
• Det anbefales å ta prøver for analyse før behandlingsstart og 2 uker etter avsluttet behandling.
• Det anbefales å donere blod om morgenen på tom mage. Helblod lagres i antikoagulantrør (EDTA, sitronsyrenatrium). Andre antikoagulantia, for eksempel heparin, er ikke tillatt fordi de hemmer PCR -reaksjonen. Serum lagres uten antikoagulant.
• Når du samler urin, er det nødvendig å samle morgenurinen (første porsjon), omtrent 30-40 ml. Det er lov å lagre prøven til den sendes til laboratoriet i ikke mer enn 2 timer.
• Skyll munnen med saltvann før du samler spytt. Det anbefales å ikke spise i 4 timer før prøven samles. Mengden prøve er fra 3 til 5 ml. Spytt samles opp umiddelbart før analyse; materialet kan lagres frosset ved minus 20 ° C.
• Engangsrør brukes til å samle oppspyttprøver. Det nødvendige prøvevolumet er fra 5 til 10 ml. Før analyse kan prøven lagres i 24 timer ved 4 ° C.
• Synovialvæsken trekkes tilbake med en sprøyte. Det anbefales å bruke sterilt engangsutstyr for innsamling og lagring av materiale. Det nødvendige prøvevolumet er 1 ml.
• For å ta en prøve av epitelet i slimhinnene, brukes prober (for eksempel fra viskose) eller cytobrushes.

Hvordan forberede seg på PCR -analyse

Riktig samling av materiale er nødvendig for å oppnå riktige testresultater, derfor anbefales det å følge følgende regler:

• Det anbefales å samle biologisk materiale under et akutt infeksjonsforløp, men antibakterielle midler bør ikke tas på dette tidspunktet.
• Før du tar prøver fra skjeden, anbefales det å slutte å ta vaginale medisiner, og heller ikke å utføre prosedyrer som douching i 24 timer.
• Før du tar en prøve fra urinrøret, bør du avstå fra å urinere i 1,5-2 timer, behandle den ytre inngangen til urinrøret med saltvann.
• Det anbefales at urinprøver tas på tom mage om morgenen.
• Før du samler inn spytt, bør mat, medisiner og alkohol seponeres 12 timer før prøvetaking. Før prøven samles, rengjøres munnhulen og tennene med en tannbørste uten pasta, munnhulen må skylles grundig med vann, uten bruk av ekstra midler. Spytt samles opp med en sprøyte.
• Når du tar skrap fra orofarynx, må du ikke spise eller drikke vann i 2 timer. Det anbefales ikke å bruke strupsspray, tyggegummi, pastiller eller pusse tennene.
• Når du samler opp sputum, anbefales det å behandle munnhulen grundig: børst tennene, skyll munnen. Samle morgen slimete eller purulent utslipp. En 3 ml prøve er tilstrekkelig for testing. For å øke sekretmengden kan du ta slimløsende inhalasjoner eller medisiner.
• Et flekk fra øyets bindehinde tas på innsiden av det nedre øyelokket, uten å berøre øyevippene.

Smørebehandling (for kvinner og menn)

Ved undersøkelse av den urogenitale kanalen hos kvinner utføres skraping av vaginal slimhinne, urinrør og livmorhalskanal. Prøver tas før manuell inspeksjon. Prøvetaking utføres ved bruk av sterile sonder med en vattpinne eller cytobrush.

Før prosedyren behandles det ytre området av urinrøret med en steril løsning, overflødig slim fjernes fra skjeden og livmorhalsen. Sonden settes inn i urinrøret eller i livmorhalskanalen til en dybde på 0,5-1,5 cm. Materialet samles med milde rotasjonsbevegelser.

En vattpinne er tatt fra baksiden av skjeden. Når du fjerner sonden, anbefales det ikke å berøre veggene i skjeden med den.

Sonden (arbeidsområdet) vaskes i et reagensrør med en transportvæske, som leveres av produsenten av et sett for PCR -diagnostikk, og klemmes mot veggene i reagensrøret. Noen ganger anbefaler kitprodusenten å bryte sonden og la arbeidsdelen ligge direkte i røret. Dette reduserer tap av prøver.

Det anbefales ikke å ta utstryk for PCR etter kolposkopi. Før du tar materialet, anbefales det å slutte å ta vaginale tabletter og medisiner om 2-3 dager. Smøret blir tatt tidligst 2-3 dager etter slutten av menstruasjonsstrømmen.

Når du tar et flekk fra menn, behandles det ytre området av urinrøret med en steril løsning, og overflødig sekresjon fjernes. En steril sonde settes inn 3-4 cm for å samle en prøve. Arbeidsdelen av sonden vaskes i et reagensrør med en transportløsning.

Hvordan dechiffreres PCR -tester

I resultatene av PCR -testen, i tillegg til navnet på analysen og testresultatene, er det angitt norm eller referanseverdier som det oppnådde resultatet kan sammenlignes med:

Analysenavn	Resultat	Norm
Chlamidia trachomatis DNA	Positiv	Negativ
Micoplasma hominis DNA	Negativ	Negativ

Et positivt resultat betyr tilstedeværelsen av et patogen -DNA i det biologiske materialet, et negativt resultat betyr dets fravær.

Ved vurdering av virusbelastning blir DNA kvantifisert. I dette tilfellet inneholder resultattabellen den numeriske verdien av antall kopier av det påviste DNA, for eksempel:

Indeks	Resultat	Referanseverdier
Kvantifisering av hepatitt B -virus -DNA	4,3 * 10v 3 st.	<300 klinisk ubetydelige; > 300 positive

Når det gjelder kvalitativ og kvantitativ analyse, vurderes resultatene av den behandlende legen.

Når du analyserer de oppnådde resultatene, oppstår ofte følgende feil:

• Tidlig kontroll PCR -test etter avsluttet antibiotikakur (etter 1-2 uker). DNA -en til det smittsomme stoffet forblir i pasientens kropp i flere uker etter at cellene til det smittsomme stoffet er ødelagt ved terapi. Derfor er det oppnådde positive resultatet falskt positivt, og konklusjonen om at terapien ikke fungerte er feil. Hvis vi snakker om årsaker til infeksjon på hudepitelet, anbefales det å utføre testen ikke tidligere enn en måned etter avsluttet behandling.
• Ved tolkning av PCR -analyse av noen infeksjonerfor eksempel cytomegalovirusinfeksjon, betyr et positivt resultat ikke alltid forløpet av den smittsomme prosessen og behovet for terapi. I bare 60% av tilfellene med positivt PCR -resultat utvikler pasienter kliniske tegn på sykdommen.
• Ved tolkning av PCR -tester for humant papillomavirus en positiv test kan feilaktig tolkes som årsaken til utviklingen av onkologiske prosesser, men hos 90% av pasientene løser HPV-infeksjonen seg etter 6-24 måneder. Hvis resultatet er positivt, er det nødvendig å gjennomføre en undersøkelse av livmorhalsens epitel, og først da vurdere risikoen for kreft.
• I studier av infeksjoner i det urogenitale området hos kvinner anbefales det ikke bare å bestemme opportunistiske infeksjoner, men også å sammenligne antallet med antall Lactovacillus, som regnes som hovedrepresentantene for den normale mikrofloraen i skjeden. En slik analyse lar deg bestemme dysbiose, korrekt tolke resultatene av PCR -testen og foreskrive terapi.

Polymerasekjedereaksjon er en metode som brukes til å kvantifisere viral og bakteriell belastning. Det må huskes på at for noen infeksjoner er det ingen klar regulering som lar deg bestemme den kliniske betydningen av resultatene som er oppnådd.

Dette betyr at tolkningen av resultatene er subjektiv og kan være feil. Så for eksempel opportunistisk Ureaplasma, Mikoplasma, Gardnerella i fravær av klager og kliniske tegn på betennelse, krever de ikke terapi. Urimelig resept på terapi fører til en økning i tilfeller av dysbiose og vaginose.

Video om PCR -analyse

PCR -diagnose av virusinfeksjon: forklaring av metoden: