Reação em cadeia da polimerase (PCR). O que é isso, um método em microbiologia, medicina, cultura, esfregaço

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método laboratorial moderno para gerar um grande número de cópias de seções individuais de ácidos nucléicos (DNA ou RNA). O PCR é usado em muitas áreas da biologia e da medicina. Em diagnósticos médicos, este método é usado para determinar doenças infecciosas.

Em biologia molecular, o propósito da cópia pode ser um pedaço de DNA para estudar a função de um determinado gene ou outros experimentos (clonar genes, introduzir outros genes, identificar mutações). Em um exame forense, o DNA é examinado para corresponder ao material genético dos suspeitos na cena do crime.

O que é análise?

No diagnóstico de doenças pelo método de PCR, uma seção específica do DNA do agente infeccioso é isolada no material biológico do paciente. Se este local for encontrado, é uma evidência direta da presença do patógeno no corpo do paciente.

A PCR também pode detectar alterações no material genético do paciente., que ajudam a determinar doenças congênitas, alterações no sistema imunológico, predisposição a várias doenças.

Ao realizar a análise de PCR, uma determinada parte da molécula de DNA ou RNA do agente causador da doença contida no material biológico é isolada da amostra por métodos especiais. Em seguida, este site é duplicado muitas vezes com a ajuda de enzimas.

A quantidade de DNA sintetizada pode ser registrada visualmente. Apenas uma determinada parte da molécula de DNA é copiada.

O PCR requer os seguintes componentes:

• Modelo de DNA (um pedaço de DNA que é repetidamente copiado e identificado),
• primers (moléculas de DNA curtas de fita simples especialmente sintetizadas necessárias para semear a síntese de DNA),
• DNA polimerase (uma enzima que catalisa a reação de polimerização do DNA), desoxinucleosídeo trifosfatos (as bases nitrogenadas são as moléculas que compõem o DNA).
• Outros componentes (íons de magnésio, solução tampão).

A reação em cadeia da polimerase é um método que requer equipamento especial (amplificador), consiste nas seguintes etapas:

• Desnaturação do DNA molde, no qual o DNA de fita dupla é clivado em duas fitas. Este estágio dura 30-40 segundos.
• A fixação de primers a regiões específicas do DNA ocorre em 20-60 segundos.
• A polimerização é a síntese de novas fitas de DNA usando uma enzima.

Após a repetição dessas etapas, o número necessário de cópias é sintetizado (após 20 ciclos, o número de cópias chega a mais de um milhão).

O registro do DNA do vírus é realizado após a amplificação em um dispositivo especial (se PCR com detecção em ponto final) ou diretamente no amplificador durante a reação (se PCR em tempo real for usado) fluorescente método.

Onde posso fazer o check-in, quanto custa

A análise de PCR pode ser realizada em qualquer laboratório médico credenciado para essa análise.

O custo do teste depende do tipo de infecção:

Laboratório	Infecção / custo
KDL	DNA de citomegalovírus - 230 rublos DNA do herpesvírus tipo 6 - 250 rublos. ARN coronavírus SARS-CoV-2/1600 rublos.
Hemoteste	DNA de citomegalovírus - 250 rublos DNA do herpesvírus tipo 6 - 240 rublos. ARN coronavírus SARS-CoV-2 - 1700 rublos.
Em vitro	DNA de citomegalovírus no sangue - 400 rublos. DNA dos tipos de herpesvírus humano 1 e 2 na raspagem de células epiteliais da pele - 570 rublos. ARN coronavírus SARS-CoV-2 - 1990 rublos.
Citylab	DNA de citomegalovírus - 240 rublos DNA do vírus herpes humano tipo 6 - 290 rublos. ARN coronavírus SARS-CoV-2 - 1.800 rublos.

Variedades de PCR

A reação em cadeia da polimerase é um método para o qual foram desenvolvidos diferentes métodos de configuração da análise.

Esses métodos foram projetados para reduzir o risco de resultados falsos positivos e falsos negativos ou para realizar resultados quantitativos ou análise qualitativa, bem como para a determinação de diferentes ácidos nucléicos: DNA (ácido desoxirribonucléico) ou RNA (ácido ribonucléico).

De acordo com o método para determinar os produtos da reação, dois tipos de PCR são distinguidos:

• PCR em tempo real - amplificação e detecção são realizadas simultaneamente em um dispositivo. Com esta modificação do PCR, é possível determinar a quantidade da sequência de DNA desejada em cada ciclo de síntese de DNA.
• PCR de ponto final - uma espécie de análise de PCR, em que os resultados são registrados pelo método de fluorescência em um dispositivo especial, após o término da reação em cadeia da polimerase.

Na prática laboratorial, existem diferentes formas de configurar a análise, tais como:

• PCR de inicialização a quente. A peculiaridade desse método é que a reação começa apenas quando uma determinada temperatura é atingida. Os componentes da reação (especialmente enzimas) são bloqueados e começam a funcionar apenas a uma determinada temperatura. Este método melhora a precisão da análise. Se a mistura de reação for aquecida gradualmente, existe o risco de formação de subprodutos da reação e, portanto, resultados de análise imprecisos.
• Para a detecção de vírus com um genoma de RNApor exemplo, hepatite C tipo ou vírus da imunodeficiência humana, um método chamado PCR de transcrição reversa (RT-PCR) é usado. O RNA do vírus é primeiro convertido em uma molécula de DNA complementar. O DNA resultante é então usado como um modelo para PCR.
• PCR multi-primer - um método de realização da reação, no qual várias sequências de DNA são copiadas simultaneamente em uma amostra. Este método permite reduzir consumíveis e reduzir o custo da análise.
• Método PCR usando tecnologia NASBA (Amplificação baseada na sequência de ácido nucleico) é que o RNA do vírus é usado como um modelo para copiar o material genético. Com a ajuda de enzimas especiais (transcriptase, RNA polimerase, RNase), o DNA complementar (cDNA) é formado no meio de reação, assim como um complexo de moléculas de RNA e cDNA. A diferença entre esta modificação e o PCR padrão é que não o DNA, mas o RNA é acumulado como material genético. A diferença entre esse método e o método RT-PCR é que o RNA não é apenas um modelo para a síntese de cDNA, mas também um produto de amplificação (ou seja, o produto final da reação).

As moléculas de DNA são destruídas no corpo por um longo tempo e podem ser detectadas em um paciente, mesmo que a terapia antiviral ou antibiótica já tenha funcionado. Portanto, o método de PCR padrão não permite avaliar a eficácia da terapia.

Ao contrário do DNA, as moléculas de RNA podem ser isoladas exclusivamente de células vivas ou vírus e, após a destruição das células vivas, a molécula de RNA também é rapidamente destruída. Esta modificação permite que você controle o efeito da terapia já no momento de sua implementação.

Vantagens e desvantagens do PCR

Em comparação com outros métodos de laboratório para detectar infecções, o método de PCR tem várias vantagens:

• O método de PCR é um método direto determinação do material genético de um vírus ou bactéria em uma amostra. Ao contrário de outros métodos que determinam sinais indiretos de infecção, o teste de PCR indica diretamente a presença de um vírus no corpo.
• Alta especificidade do método, ou seja, a capacidade de identificar um patógeno específico está associada ao fato de ser determinado material genético exclusivo de um determinado organismo (vírus, bactéria, fungo microscópico). Portanto, a especificidade desse método é próxima a 100%.
• Alta sensibilidade do método (também próximo de 100%) é a quantidade de amostra que pode ser determinada por este método. Mesmo uma pequena quantidade de vírus ou moléculas bacterianas no material biológico é determinada. Isso permite identificar o portador do vírus antes mesmo do início dos sintomas.
• O método é universal para detectar DNA / RNA de qualquer vírus ou bactérias. Com a ajuda da PCR, é possível determinar infecções, bem como doenças crônicas.
• Método de análise rápido, a duração é de cerca de 4-6 horas.

Imperfeições:

• A reação em cadeia da polimerase é um método de detecção direta do material genético (DNA) do patógeno, e não permite avaliar a eficácia da terapia, uma vez que a molécula de DNA não é destruída por muito tempo, mesmo que a terapia já tenha sido trabalhado.
• A alta sensibilidade do método pode ser sua desvantagem. Por exemplo, após a conclusão da terapia, a PCR ainda detecta o DNA de células mortas em um paciente saudável, obtendo assim um resultado falso positivo.
• Diferentes fabricantes de testes de PCR podem detectar as mesmas infecções usando sistemas diferentes. Portanto, os resultados da determinação da mesma infecção em laboratórios podem ser diferentes. Recomenda-se que os testes quantitativos dinâmicos sejam realizados no mesmo laboratório.
• Alguns testes, especialmente testes genéticos, podem ser bastante caros.
• Para realizar os testes de PCR, são necessários equipamentos caros, reagentes e pessoal qualificado e bem treinado. A precisão dos resultados da análise depende da qualidade dos reagentes e do método de coleta das amostras biológicas.

Para identificar quais infecções o PCR é adequado (âmbito de aplicação do método na medicina)

Método PCR é usado para a identificação, ou seja, a determinação qualitativa, bem como para a determinação quantitativa de DNA e RNA de patógenos de várias infecções:

• vírus da imunodeficiência humana (HIV);
• vírus da hepatite A, B, C, D, G;
• patógenos que causam doenças do trato urogenital, por exemplo, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• patógenos que causam disbiose do trato urogenital e candidíase, por exemplo, microrganismos como Saccharimonas aalborgensis, fungos microscópicos do gênero Candida;
• agentes causadores de infecções por papilomavírus humano;
• Infecções por TORCH e Herpesvirus;
• patógenos de infecções focais naturais que podem ser transmitidos por pássaros, animais, insetos sugadores de sangue, por exemplo, borreliose, encefalite, febre do Nilo Ocidental;
• infecções gastrointestinais;
• agentes causadores da tuberculose;
• infecções respiratórias (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• infecções nosocomiais (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

Além disso, a carga viral é determinada pelo método de PCR, a dinâmica da doença e o efeito da terapia são investigados.

A reação em cadeia da polimerase na medicina tem outra aplicação importante - é a determinação de polimorfismos de genes humanos (alterações locais) e mutações. Pequenas mudanças locais na sequência de DNA de diferentes genes são a causa do desenvolvimento de várias doenças.

Essas doenças podem ser hereditárias. O método de PCR permite identificar essas mutações e prevenir o desenvolvimento ou aliviar o curso de doenças.

O PCR é usado para detectar mutações que causam o desenvolvimento de doenças como:

• violação da coagulação do sangue;
• doenças cardiovasculares;
• distúrbios metabólicos (por exemplo, intolerância à lactose);
• função reprodutiva prejudicada (mutações que causam infertilidade masculina);
• câncer de mama e ovário;
• doenças autoimunes.

Amostras para pesquisa

Dependendo do tipo de infecção detectada, as amostras para análise podem ser amostras de fluidos biológicos, tecidos, células epiteliais:

• soro / plasma sanguíneo, sangue periférico do cordão umbilical;
• amostras de epitélio da mucosa (canal cervical, vagina, uretra);
• raspagem da conjuntiva, cavidade nasal ou orofaringe;
• sêmen, secreção da próstata;
• raspagem de lesões erosivas e ulcerativas;
• urina;
• escarro;
• fezes;
• outros fluidos biológicos (líquido amniótico, líquido cefalorraquidiano, líquido amniótico, líquido articular);
• material de biópsia dos pulmões, fígado, trato gastrointestinal;
• lavado broncoalveolar.

Regras para a entrega de fluidos biológicos para PCR

A reação em cadeia da polimerase é um método que exige estrita adesão às recomendações, mesmo na fase de coleta de material biológico.

A amostragem inadequada pode levar a resultados falsos positivos ou falsos negativos.

• Se um meio de transporte especial for necessário para o transporte e armazenamento de material biológico antes da análise, recomenda-se a utilização de solução de transporte fabricada pela mesma empresa fornecedora dos kits PCR teste.
• A amostragem para teste de PCR é realizada separadamente das amostras destinadas a outros estudos. Instrumentos esterilizados descartáveis, recipientes e luvas são usados ​​para seleção.
• Recomenda-se colher amostras para análise antes do início da terapia e 2 semanas após o seu término.
• Recomenda-se doar sangue pela manhã com o estômago vazio. O sangue total é armazenado em tubos anticoagulantes (EDTA, sal de sódio do ácido cítrico). Outros anticoagulantes, como a heparina, não são permitidos porque inibem a reação de PCR. O soro é armazenado sem anticoagulante.
• Ao coletar a urina, é necessário coletar a urina da manhã (primeira porção), cerca de 30-40 ml. É permitido armazenar a amostra até o seu envio ao laboratório por no máximo 2 horas.
• Antes de coletar a saliva, enxágue a boca com soro fisiológico. Recomenda-se não comer por 4 horas antes da coleta da amostra. A quantidade de amostra é de 3 a 5 ml. A saliva é coletada imediatamente antes da análise; o material pode ser armazenado congelado a menos 20 ° C.
• Tubos descartáveis ​​são usados ​​para coletar amostras de escarro. O volume de amostra necessário é de 5 a 10 ml. Antes da análise, a amostra pode ser armazenada por 24 horas a 4 ° C.
• O líquido sinovial é retirado com uma seringa. Recomenda-se a utilização de equipamentos estéreis descartáveis ​​para coleta e armazenamento do material. O volume de amostra necessário é de 1 ml.
• Para obter uma amostra do epitélio das membranas mucosas, são utilizadas sondas (por exemplo, de viscose) ou citoescovas.

Como se preparar para a análise PCR

A coleta correta de material é necessária para obter resultados de teste corretos, portanto, é recomendado observar as seguintes regras:

• Recomenda-se coletar material biológico durante um curso agudo de infecção, mas os agentes antibacterianos não devem ser tomados neste momento.
• Antes de colher amostras da vagina, é recomendável interromper a ingestão de medicamentos vaginais e também não realizar procedimentos como duchas higiênicas por 24 horas.
• Antes de tirar uma amostra da uretra, você deve evitar urinar por 1,5-2 horas, trate a entrada externa da uretra com solução salina.
• Recomenda-se que as amostras de urina sejam coletadas com o estômago vazio pela manhã.
• Antes da coleta de saliva, alimentos, medicamentos e álcool são interrompidos 12 horas antes da coleta da amostra. Antes da coleta da amostra, a cavidade oral e os dentes são limpos com uma escova de dentes sem pasta, a cavidade oral deve ser bem enxaguada com água, sem o uso de agentes adicionais. A saliva é coletada com uma seringa.
• Ao tirar raspagens da orofaringe, não coma ou beba água por 2 horas. Não é recomendado usar sprays para a garganta, gomas de mascar, pastilhas ou escovar os dentes.
• Ao coletar o escarro, é recomendável processar minuciosamente a cavidade oral: escovar os dentes, enxaguar a boca. Colete secreção mucosa ou purulenta matinal. Uma amostra de 3 ml é suficiente para o teste. Para aumentar o volume das secreções, você pode tomar inalações expectorantes ou medicamentos.
• Um esfregaço da conjuntiva do olho é obtido do lado interno da pálpebra inferior, sem tocar os cílios.

Procedimento de esfregaço (para mulheres e homens)

Ao examinar o trato urogenital em mulheres, é realizada a raspagem da mucosa vaginal, da uretra e do canal cervical. As amostras são coletadas antes da inspeção manual. A amostragem é realizada usando sondas estéreis com um cotonete ou cytobrush.

Antes do procedimento, a área externa da uretra é tratada com uma solução estéril, o excesso de muco é removido da vagina e do colo do útero. A sonda é inserida na uretra ou no canal cervical a uma profundidade de 0,5-1,5 cm. O material é coletado com movimentos rotacionais suaves.

Um cotonete é retirado da parte de trás da vagina. Ao remover a sonda, não é recomendável tocar as paredes da vagina com ela.

A sonda (sua área de trabalho) é lavada em um tubo de ensaio com um líquido de transporte, fornecido pelo fabricante de um kit para diagnóstico de PCR, e comprimida contra as paredes do tubo de ensaio. Às vezes, o fabricante do kit recomenda quebrar a sonda e deixar a parte de trabalho diretamente no tubo. Isso reduz a perda de amostra.

Não é recomendado fazer esfregaços para PCR após a colposcopia. Antes de tomar o material, é recomendado parar de tomar comprimidos e medicamentos vaginais em 2-3 dias. O esfregaço é coletado não antes de 2-3 dias após o final do fluxo menstrual.

Ao fazer um esfregaço de homens, a região externa da uretra é tratada com uma solução estéril e o excesso de secreções é removido. Uma sonda estéril é inserida 3-4 cm para coletar uma amostra. A parte útil da sonda é lavada em um tubo de ensaio com uma solução de transporte.

Como os testes de PCR são decifrados

Nos resultados do teste de PCR, além do nome da análise e dos resultados do teste, é indicado norma ou valores de referência com os quais o resultado obtido pode ser comparado:

Nome da análise	Resultado	Norma
DNA de Chlamidia trachomatis	Positivo	Negativo
DNA de Micoplasma hominis	Negativo	Negativo

Um resultado positivo significa a presença de um DNA do patógeno no material biológico, um resultado negativo significa sua ausência.

Ao avaliar a carga viral, o DNA é quantificado. Nesse caso, a tabela de resultados contém o valor numérico da quantidade de cópias do DNA detectado, por exemplo:

Índice	Resultado	Valores de referência
Quantificação do DNA do vírus da hepatite B	4,3 * 10v 3 st.	<300 clinicamente insignificante; > 300 positivo

No caso de análises qualitativas e quantitativas, os resultados são avaliados pelo médico assistente.

Ao analisar os resultados obtidos, os seguintes erros são frequentemente encontrados:

• Teste de PCR de controle precoce após o término do tratamento com antibióticos (após 1-2 semanas). O DNA do agente infeccioso permanece no corpo do paciente por várias semanas depois que as células do agente infeccioso são destruídas pela terapia. Portanto, o resultado positivo obtido é falso positivo, e a conclusão de que a terapia não funcionou é errônea. Se se trata de agentes causadores de infecção no epitélio da pele, recomenda-se que o teste seja realizado no máximo um mês após o término do tratamento.
• Ao interpretar a análise de PCR de algumas infecções, por exemplo, infecção por citomegalovírus, um resultado positivo nem sempre significa o curso do processo infeccioso e a necessidade de terapia. Em apenas 60% dos casos com resultado de PCR positivo, os pacientes desenvolvem sinais clínicos da doença.
• Ao interpretar os testes de PCR para o papilomavírus humano um teste positivo pode ser erroneamente interpretado como a causa do desenvolvimento de processos oncológicos, embora em 90% dos pacientes a infecção pelo HPV remita em 6-24 meses. Se o resultado for positivo, é necessário fazer um estudo do epitélio do colo do útero, e só então avaliar o risco de desenvolver câncer.
• Em estudos de infecções do trato urogenital em mulheres, é recomendado não apenas para determinar infecções oportunistas, mas também para comparar seu número com o número de Lactovacilos, que são considerados os principais representantes da microflora normal da vagina. Essa análise permite determinar a disbiose, interpretar corretamente os resultados do teste PCR e prescrever a terapia.

A reação em cadeia da polimerase é um método usado para estudar quantitativamente a carga viral e bacteriana. Deve-se ter em mente que para algumas infecções não existe uma regulamentação clara que permita determinar o significado clínico dos resultados obtidos.

Isso significa que a interpretação dos resultados é subjetiva e pode estar errada. Então, por exemplo, oportunista Ureaplasma, Micoplasma, Gardnerella na ausência de queixas e sinais clínicos de inflamação, não requerem terapia. A prescrição de terapia não razoável leva a um aumento nos casos de disbiose e vaginose.

Vídeo sobre análise de PCR

Diagnóstico de PCR de infecção viral: explicação do método: