Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Qué es, un método en microbiología, medicina, cultivo, frotis

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método de laboratorio moderno para generar una gran cantidad de copias de secciones individuales de ácidos nucleicos (ADN o ARN). La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina. En el diagnóstico médico, este método se utiliza para determinar enfermedades infecciosas.

En biología molecular, el propósito de la copia puede ser un fragmento de ADN para estudiar la función de un gen en particular u otros experimentos (clonar genes, introducir otros genes, identificar mutaciones). En un examen forense, se examina el ADN para que coincida con el material genético de los sospechosos en la escena del crimen.

¿Qué es el análisis?

En el diagnóstico de enfermedades. utilizando el método de PCR, se aísla una sección específica del ADN del agente infeccioso en el material biológico del paciente. Si se encuentra este sitio, esto es evidencia directa de la presencia del patógeno en el cuerpo del paciente.

La PCR también puede detectar cambios en el material genético del paciente., que ayudan a determinar enfermedades congénitas, cambios en el sistema inmunológico, predisposición a diversas enfermedades.

Al realizar el análisis de PCR, una determinada parte de la molécula de ADN o ARN del agente causante de la enfermedad contenida en el material biológico se aísla de la muestra mediante métodos especiales. Luego, este sitio se duplica muchas veces con la ayuda de enzimas.

Se sintetiza la cantidad de ADN que se puede registrar visualmente. Solo se copia una determinada parte de la molécula de ADN.

PCR requiere los siguientes componentes:

• Plantilla de ADN (un fragmento de ADN que se copia e identifica repetidamente),
• cebadores (moléculas cortas de ADN monocatenarias especialmente sintetizadas necesarias para sembrar la síntesis de ADN),
• ADN polimerasa (una enzima que cataliza la reacción de polimerización del ADN), desoxinucleósidos trifosfatos (las bases nitrogenadas son las moléculas que componen el ADN).
• Otros componentes (iones magnesio, solución tampón).

La reacción en cadena de la polimerasa es un método que requiere un equipo especial (amplificador), consta de los siguientes pasos:

• Desnaturalización del ADN molde, en el que el ADN de doble hebra se escinde en dos hebras. Esta etapa tiene una duración de 30 a 40 segundos.
• La unión de cebadores a regiones específicas de ADN se produce en 20 a 60 segundos.
• La polimerización es la síntesis de nuevas cadenas de ADN utilizando una enzima.

Después de la repetición repetida de estas etapas, se sintetiza el número requerido de copias (después de 20 ciclos, el número de copias alcanza más de un millón).

El registro del ADN del virus se lleva a cabo después de la amplificación en un dispositivo especial (si la PCR con detección en punto final) o directamente en el amplificador durante la reacción (si se usa PCR en tiempo real) fluorescente método.

¿Dónde puedo registrarme, cuánto cuesta?

El análisis de PCR se puede realizar en cualquier laboratorio médico acreditado para este análisis.

El costo de la prueba depende del tipo de infección:

Laboratorio	Infección / costo
KDL	ADN del citomegalovirus - 230 rublos ADN del virus del herpes tipo 6-250 rublos. ARN coronavirus SARS-CoV-2/1600 rublos.
Hemotest	ADN de citomegalovirus - 250 rublos ADN del virus del herpes tipo 6-240 rublos. ARN coronavirus SARS-CoV-2 - 1700 rublos.
Invitro	ADN de citomegalovirus en la sangre - 400 rublos. ADN de los tipos 1 y 2 del virus del herpes humano en el raspado de las células epiteliales de la piel - 570 rublos. ARN coronavirus SARS-CoV-2 - 1990 rublos.
Citylab	ADN del citomegalovirus - 240 rublos ADN del virus del herpes humano tipo 6 - 290 rublos. ARN coronavirus SARS-CoV-2 - 1800 rublos.

Variedades de PCR

La reacción en cadena de la polimerasa es un método para el que se han desarrollado diferentes métodos de configuración del análisis.

Estos métodos fueron diseñados para reducir el riesgo de resultados falsos positivos y falsos negativos, o para realizar análisis cuantitativos. o análisis cualitativo, así como para la determinación de diferentes ácidos nucleicos: ADN (ácido desoxirribonucleico) o ARN (ácido ribonucleico).

Según el método para determinar los productos de reacción, se distinguen dos tipos de PCR:

• PCR en tiempo real - la amplificación y la detección se llevan a cabo simultáneamente en un dispositivo. Con esta modificación de la PCR, es posible determinar la cantidad de la secuencia de ADN deseada en cada ciclo de síntesis de ADN.
• PCR de punto final - una especie de análisis de PCR, en el que los resultados se registran mediante el método de fluorescencia en un dispositivo especial, una vez finalizada la reacción en cadena de la polimerasa.

En la práctica de laboratorio, existen diferentes formas de configurar el análisis, tales como:

• PCR de inicio en caliente. La peculiaridad de este método es que la reacción comienza solo cuando se alcanza una cierta temperatura. Los componentes de la reacción (especialmente las enzimas) se bloquean y comienzan a funcionar solo a cierta temperatura. Este método mejora la precisión del análisis. Si la mezcla de reacción se calienta gradualmente, existe el riesgo de formación de subproductos de reacción y, por lo tanto, resultados de análisis inexactos.
• Para la detección de virus con genoma de ARNpor ejemplo, el tipo de hepatitis C o el virus de la inmunodeficiencia humana, se utiliza un método llamado PCR de transcripción inversa (RT-PCR). El ARN del virus se convierte primero en una molécula de ADN complementaria. El ADN resultante se utiliza luego como molde para la PCR.
• PCR de cebadores múltiples - un método para llevar a cabo la reacción, en el que varias secuencias de ADN se copian simultáneamente en una muestra. Este método le permite reducir los consumibles y reducir el costo de análisis.
• Método de PCR con tecnología NASBA (Amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico) es que el ARN del virus se utiliza como plantilla para copiar material genético. Con la ayuda de enzimas especiales (transcriptasa, ARN polimerasa, ARNasa), se forma ADN complementario (ADNc) en el medio de reacción, así como un complejo de moléculas de ARN y ADNc. La diferencia entre esta modificación y la PCR estándar es que no se acumula ADN, sino ARN como material genético. La diferencia entre este método y el método de RT-PCR es que el ARN no solo es una plantilla para la síntesis de ADNc, sino también un producto de amplificación (es decir, el producto final de la reacción).

Las moléculas de ADN se destruyen en el cuerpo durante mucho tiempo y pueden detectarse en un paciente incluso si la terapia antiviral o antibiótica ya ha funcionado. Por tanto, el método de PCR estándar no permite evaluar la eficacia de la terapia.

A diferencia del ADN, las moléculas de ARN se pueden aislar exclusivamente de células vivas o virus y, después de la destrucción de las células vivas, la molécula de ARN también se destruye rápidamente. Esta modificación le permite controlar el efecto de la terapia ya en el momento de su implementación.

Ventajas y desventajas de la PCR

En comparación con otros métodos de laboratorio para detectar infecciones, el método de PCR tiene varias ventajas:

• El método de PCR es un método directo determinación del material genético de un virus o bacteria en una muestra. A diferencia de otros métodos que determinan signos indirectos de infección, la prueba de PCR indica directamente la presencia de un virus en el cuerpo.
• Alta especificidad del método., es decir, la capacidad de identificar un patógeno específico está asociada con el hecho de que se determina material genético que es exclusivo de un organismo determinado (virus, bacterias, hongos microscópicos). Por tanto, la especificidad de este método se acerca al 100%.
• Alta sensibilidad del método. (también cercana al 100%) es la cantidad de muestra que se puede determinar mediante este método. Incluso se determina una pequeña cantidad de virus o moléculas bacterianas en el material biológico. Esto permite identificar al portador del virus incluso antes de la aparición de los síntomas.
• El método es universal para detectar ADN / ARN de cualquier virus. o bacterias. Con la ayuda de la PCR, es posible determinar cualquier infección, así como enfermedades crónicas.
• Método de análisis rápido, la duración es de aproximadamente 4-6 horas.

Defectos:

• La reacción en cadena de la polimerasa es un método para la detección directa del material genético (ADN) del patógeno y no permite evaluar la efectividad de la terapia, ya que la molécula de ADN no se destruye durante mucho tiempo, incluso si la terapia ya está trabajó.
• La alta sensibilidad del método puede ser su desventaja. Por ejemplo, después de completar la terapia, la PCR aún detecta el ADN de las células muertas en un paciente sano, obteniendo así un resultado falso positivo.
• Diferentes fabricantes de pruebas de PCR pueden detectar las mismas infecciones utilizando diferentes sistemas. Por lo tanto, los resultados de determinar la misma infección en laboratorios pueden diferir. Se recomienda realizar pruebas cuantitativas dinámicas en el mismo laboratorio.
• Algunas pruebas, especialmente las genéticas, pueden ser bastante caras.
• Para realizar las pruebas de PCR, se requieren equipos costosos, reactivos y personal calificado bien capacitado. La precisión de los resultados del análisis depende de la calidad de los reactivos y del método de toma de muestras biológicas.

Identificar qué infecciones es adecuada la PCR (ámbito de aplicación del método en medicina)

Se utiliza el método de PCR para la identificación, es decir, la determinación cualitativa, así como para la determinación cuantitativa de ADN y ARN de patógenos de diversas infecciones:

• virus de inmunodeficiencia humana (VIH);
• virus de la hepatitis A, B, C, D, G;
• patógenos que causan enfermedades del tracto urogenital, por ejemplo, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma;
• patógenos que causan disbiosis del tracto urogenital y candidiasis, por ejemplo, microorganismos como Saccharimonas aalborgensis, hongos microscópicos del género Candida;
• agentes causantes de infecciones por virus del papiloma humano;
• Infecciones por TORCH y Herpesvirus;
• patógenos de infecciones focales naturales que pueden ser transmitidas por aves, animales, insectos chupadores de sangre, por ejemplo, borreliosis, encefalitis, fiebre del Nilo Occidental;
• infecciones gastrointestinales;
• agentes causantes de la tuberculosis;
• infecciones respiratorias (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae);
• Infecciones nosocomiales (Enterococcus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae).

Además, la carga viral se determina mediante el método de PCR, se investigan la dinámica de la enfermedad y el efecto de la terapia.

La reacción en cadena de la polimerasa en medicina tiene otra aplicación importante: es la determinación de polimorfismos de genes humanos (cambios locales) y mutaciones. Los cambios locales menores en la secuencia de ADN de diferentes genes son la causa del desarrollo de diversas enfermedades.

Estas enfermedades pueden heredarse. El método de PCR le permite identificar estas mutaciones y prevenir el desarrollo o aliviar el curso de enfermedades.

La PCR se utiliza para detectar mutaciones que provocan el desarrollo de enfermedades como:

• violación de la coagulación sanguínea;
• enfermedades cardiovasculares;
• trastornos metabólicos (por ejemplo, intolerancia a la lactosa);
• función reproductiva alterada (mutaciones que causan infertilidad masculina);
• cáncer de mama y de ovario;
• Enfermedades autoinmunes.

Muestras para investigación

Dependiendo del tipo de infección detectada, las muestras para análisis pueden ser muestras de fluidos biológicos, tejidos, células epiteliales:

• suero / plasma sanguíneo, sangre periférica, del cordón umbilical;
• muestras de epitelio mucoso (canal cervical, vagina, uretra);
• raspados de conjuntiva, cavidad nasal, orofaringe;
• semen, secreción de próstata;
• raspado de lesiones erosivas y ulcerativas;
• orina;
• esputo;
• heces;
• otros fluidos biológicos (amniótico, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido articular);
• material de biopsia de los pulmones, hígado, tracto gastrointestinal;
• lavado broncoalveolar.

Reglas para la entrega de fluidos biológicos para PCR.

La reacción en cadena de la polimerasa es un método que requiere un estricto cumplimiento de las recomendaciones incluso en la etapa de recolección de material biológico.

Un muestreo inadecuado puede dar lugar a resultados falsos positivos o falsos negativos.

• Si se requiere un medio de transporte especial para el transporte y almacenamiento de material biológico antes del análisis, se recomienda utilizar una solución de transporte fabricada por la misma empresa que suministra los kits de PCR prueba.
• El muestreo para la prueba de PCR se lleva a cabo por separado de las muestras destinadas a otros estudios. Para la selección se utilizan instrumentos, recipientes y guantes estériles desechables.
• Se recomienda tomar muestras para su análisis antes del inicio de la terapia y 2 semanas después de su finalización.
• Se recomienda donar sangre por la mañana en ayunas. La sangre entera se almacena en tubos anticoagulantes (EDTA, sal sódica del ácido cítrico). Otros anticoagulantes, como la heparina, no están permitidos porque inhiben la reacción de PCR. El suero se almacena sin anticoagulante.
• Al recolectar orina, es necesario recolectar la orina de la mañana (primera porción), alrededor de 30-40 ml. Se permite almacenar la muestra hasta que se envíe al laboratorio por no más de 2 horas.
• Antes de recolectar saliva, enjuague la boca con solución salina. Se recomienda no comer durante 4 horas antes de recolectar la muestra. La cantidad de muestra es de 3 a 5 ml. La saliva se recolecta inmediatamente antes del análisis; el material se puede almacenar congelado a menos 20 ° C.
• Los tubos desechables se utilizan para recolectar muestras de esputo. El volumen de muestra requerido es de 5 a 10 ml. Antes del análisis, la muestra se puede almacenar durante 24 horas a 4 ° C.
• El líquido sinovial se extrae con una jeringa. Se recomienda utilizar equipo estéril desechable para la recolección y almacenamiento de material. El volumen de muestra requerido es de 1 ml.
• Para tomar una muestra del epitelio de las membranas mucosas, se utilizan sondas (por ejemplo, de viscosa) o citocepillos.

Cómo prepararse para el análisis de PCR

La recolección correcta de material es necesaria para obtener resultados de prueba correctos, por lo que se recomienda observar las siguientes reglas:

• Se recomienda recolectar material biológico durante un curso agudo de infección, pero no se deben tomar agentes antibacterianos en este momento.
• Antes de tomar muestras de la vagina, se recomienda dejar de tomar medicamentos vaginales y no realizar procedimientos como duchas vaginales durante 24 horas.
• Antes de tomar una muestra de la uretra, debe abstenerse de orinar durante 1,5-2 horas, trate la entrada externa de la uretra con solución salina.
• Se recomienda que las muestras de orina se recolecten con el estómago vacío por la mañana.
• Antes de recolectar saliva, se deben suspender los alimentos, los medicamentos y el alcohol 12 horas antes de la recolección de la muestra. Antes de recolectar la muestra, la cavidad bucal y los dientes se limpian con un cepillo de dientes sin pasta, la cavidad bucal debe enjuagarse a fondo con agua, sin el uso de agentes adicionales. La saliva se recolecta con una jeringa.
• Al tomar raspaduras de la orofaringe, no coma ni beba agua durante 2 horas. No se recomienda usar aerosoles para la garganta, chicles, pastillas o cepillarse los dientes.
• Al recolectar esputo, se recomienda procesar a fondo la cavidad bucal: cepíllese los dientes, enjuáguese la boca. Recolecte la secreción mucosa o purulenta de la mañana. Una muestra de 3 ml es suficiente para realizar la prueba. Para aumentar el volumen de secreciones, puede tomar inhalaciones o medicamentos expectorantes.
• Se toma un frotis de la conjuntiva del ojo en el lado interno del párpado inferior, sin tocar las pestañas.

Procedimiento de frotis (para mujeres y hombres)

Al examinar el tracto urogenital en mujeres, se realiza un raspado de la mucosa vaginal, la uretra y el canal cervical. Las muestras se toman antes de la inspección manual. El muestreo se realiza utilizando sondas estériles con un hisopo o un citocepillo.

Antes del procedimiento, el área externa de la uretra se trata con una solución estéril, el exceso de moco se elimina de la vagina y el cuello uterino. La sonda se inserta en la uretra o en el canal cervical hasta una profundidad de 0,5 a 1,5 cm. El material se recoge con suaves movimientos de rotación.

Se toma un hisopo de la parte posterior de la vagina. Al retirar la sonda, no se recomienda tocar las paredes de la vagina con ella.

La sonda (su área de trabajo) se lava en un tubo de ensayo con un líquido de transporte, que es suministrado por el fabricante de un kit para diagnóstico por PCR, y se aprieta contra las paredes del tubo de ensayo. A veces, el fabricante del kit recomienda romper la sonda y dejar la parte de trabajo directamente en el tubo. Esto reduce la pérdida de muestra.

No se recomienda realizar frotis para PCR después de la colposcopia. Antes de tomar el material, se recomienda dejar de tomar tabletas y medicamentos vaginales en 2-3 días. El frotis se toma no antes de 2-3 días después del final del flujo menstrual.

Al tomar un frotis de hombres, la región externa de la uretra se trata con una solución estéril y se eliminan las secreciones en exceso. Se inserta una sonda estéril 3-4 cm para recolectar una muestra. La parte de trabajo de la sonda se lava en un tubo de ensayo con una solución de transporte.

¿Cómo se descifran las pruebas de PCR?

En los resultados de la prueba de PCR, además del nombre del análisis y los resultados de la prueba, se indica valores normativos o de referencia con los que se puede comparar el resultado obtenido:

Nombre del análisis	Resultado	Norma
ADN de Chlamidia trachomatis	Positivo	Negativo
ADN de Micoplasma hominis	Negativo	Negativo

Un resultado positivo significa la presencia de un ADN patógeno en el material biológico, un resultado negativo significa su ausencia.

Al evaluar la carga viral, se cuantifica el ADN. En este caso, la tabla de resultados contiene el valor numérico del número de copias del ADN detectado, por ejemplo:

Índice	Resultado	Valores de referencia
Cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B	4,3 * 10v 3 st.	<300 clínicamente insignificante; > 300 positivo

En el caso de análisis cualitativo y cuantitativo, los resultados son evaluados por el médico tratante.

Al analizar los resultados obtenidos, a menudo se encuentran los siguientes errores:

• Prueba de PCR de control temprano después del final del ciclo de antibióticos (después de 1-2 semanas). El ADN del agente infeccioso permanece en el cuerpo del paciente durante varias semanas después de que la terapia destruye las células del agente infeccioso. Por lo tanto, el resultado positivo obtenido es falso positivo y la conclusión de que la terapia no funcionó es errónea. Si estamos hablando de agentes causantes de la infección en el epitelio de la piel, se recomienda que la prueba se realice no antes de un mes después del final del tratamiento.
• Al interpretar el análisis de PCR de algunas infecciones, por ejemplo, infección por citomegalovirus, un resultado positivo no siempre significa el curso del proceso infeccioso y la necesidad de terapia. En solo el 60% de los casos con un resultado de PCR positivo, los pacientes desarrollan signos clínicos de la enfermedad.
• Al interpretar las pruebas de PCR para el virus del papiloma humano una prueba positiva puede interpretarse erróneamente como la causa del desarrollo de procesos oncológicos, aunque en el 90% de los pacientes la infección por VPH se resuelve en 6-24 meses. Si el resultado es positivo, es necesario realizar un estudio del epitelio del cuello uterino y solo luego evaluar el riesgo de cáncer.
• En estudios de infecciones del tracto urogenital en las mujeres, se recomienda no solo determinar las infecciones oportunistas, sino también comparar su número con el número de Lactovacillus, que se consideran los principales representantes de la microflora normal de la vagina. Dicho análisis le permite determinar la disbiosis, interpretar correctamente los resultados de la prueba de PCR y prescribir la terapia.

La reacción en cadena de la polimerasa es un método que se utiliza para estudiar cuantitativamente la carga viral y bacteriana. Hay que tener en cuenta que para algunas infecciones no existe una normativa clara que permita determinar la trascendencia clínica de los resultados obtenidos.

Esto significa que la interpretación de los resultados es subjetiva y puede ser errónea. Entonces, por ejemplo, oportunista Ureaplasma, Micoplasma, Gardnerella en ausencia de quejas y signos clínicos de inflamación, no requieren terapia. La prescripción irrazonable de terapia conduce a un aumento de los casos de disbiosis y vaginosis.

Video sobre análisis de PCR

Diagnóstico por PCR de la infección viral: explicación del método: